一种诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法，利用NR5A1(又名steroidogenic factor 1，SF1)基因的表达及小分子化合物Forskolin、DAPT、Purmorphamine，诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞。本发明专利技术所诱导的Leydig样细胞是由人皮肤成纤维细胞通过转录因子NR5A1及小分子化合物直接重编程而得，不经过干细胞阶段，避免移植时成瘤风险。本发明专利技术方法能简单、快速地将人皮肤成纤维细胞重编程为功能性Leydig样细胞，它可以分泌睾酮，有助于治疗男性性腺功能低下症。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法
本专利技术涉及细胞生物学与组织工程领域，尤其涉及一种利用NR5A1和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法。
技术介绍
Leydig细胞移植技术通过把Leydig细胞或体内外诱导的功能性Leydig样细胞移植入体内发挥作用，希望替代传统激素替代方法治疗男性原发性性腺功能低下症。因此Leydig细胞移植技术需要大量安全、有效的种子细胞。传统应用的种子细胞包括干细胞诱导的Leydig样细胞以及成纤维细胞重编程的Leydig样细胞。与传统的雄激素替代治疗相比，Leydig细胞移植技术不仅可以模拟体内正常的激素分泌，且避免了激素治疗带来的血红蛋白、红细胞压积、冠状动脉钙化斑块体积升高及高密度脂蛋白胆固醇下降等副作用。已证实体外移植功能性的Leydig细胞可以治疗去势小鼠，恢复血清睾酮水平。然而对于临床而言，人Leydig细胞不仅来源少且难以符合伦理。干细胞诱导或成纤维细胞重编程的Leydig样细胞则同时解决了这两个问题。利用干细胞诱导或成纤维细胞重编程技术已经可以使细胞分化或直接转变成心肌细胞、神经细胞、胰岛β细胞等多种不同类型的功能细胞。此外，成纤维细胞还可以被先重编程为多能干细胞再间接转变成各种体细胞。这些从干细胞诱导、或成纤维细胞直接/间接转分化而来的功能性体细胞获得了各种目的细胞的典型特征与功能，且不再保持原细胞的基因表达谱等分子与细胞特性。这些诱导性功能细胞不仅可以用来模拟相关的疾病，还可以通过移植到疾病动物模型体内达到治疗目的。目前，ZHANGZY等人及XINGX等人分别发现干细胞能通过体内诱导或体外通过黄体生成素(luteinizinghormone，LH)、甲状腺激素(thyroidhormone)、胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor1，IGF-1)、血小板源性生长因子-BB(plateletderivedgrowthfactor-BB，PDGF-BB)在胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium)存在条件下诱导分化成功能性的Leydig样细胞。HOUYP等人及YANGY等人分别发现成纤维细胞能通过转染SF-1,GATA4、NGFI-B或Dmrt1、Gata4、Nr5a1重编程为功能性Leydig样细胞，验证了NR5A1的关键作用。然而无论是干细胞诱导还是基因操纵方式都存在潜在致瘤性，且后者还牵涉病毒感染风险，不利于临床应用。近年来，小分子化合物(<900Da)由于其高效、安全、稳定、易储存等特性逐渐引起了研究者们的重视，并有逐步替代传统基因操纵方法的趋势。它可以直接透过细胞膜，不需要任何病毒载体，无免疫原性，且易量化、易标准化、易调控。与传统基因操纵方式不同，它主要通过调控特定信号通路，或表观遗传及代谢相关过程起作用，更利于潜在机制的研究。2010年以来，完全利用小分子化合物，人们已成功将成纤维细胞重编程为多能干细胞、心肌细胞、神经细胞等，证明了它在再生医学领域的巨大潜在价值。另外，小分子化合物本身基于生物合成化学设计而诞生，因此在功能结构上具有无限可能及优化特性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法，所述方法为利用NR5A1基因的表达及小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞，所述小分子化合物为Forskolin、DAPT和Purmorphamine的混合物。作为一个优选方案，所述方法为先构建携带NR5A1的慢病毒转染人皮肤成纤维细胞，使人皮肤成纤维细胞表达NR5A1，然后将病毒转染后的皮肤成纤维细胞用普通培养液培养3-4天，待NR5A1稳定表达后，更换为信号分子诱导液再继续培养，7-14天后可诱导为Leydig样细胞，所述信号分子诱导液是在普通培养液中加入Forskolin、DAPT和Purmorphamine三种物质组成的。作为一个优选方案，所述普通培养液配方是，10％胎牛血清+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。作为一个优选方案，所述信号分子诱导液是在普通培养液中加入10μMForskolin、5μMDAPT和0.1μMPurmorphamine三种物质组成的。作为一个优选方案，所述方法的详细步骤如下：(一)质粒构建和细胞培养1.1细胞培养先采集普通人皮肤成纤维细胞，将人皮肤成纤维细胞培养于由10％胎牛血清+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基组成的普通培养液中，并贴壁于6孔板中；接种细胞密度(3-5)×104/cm2，培养于37℃，5％CO2的培养箱中；1.2质粒构建将人NR5A1插入到含GFP的pGMLV载体中，并构建含GFP的pGMLV空载质粒；(二)病毒转染细胞慢病毒包装与转染：目的基因NR5A1质粒与病毒包装辅助质粒通过氯化钙法共转染HEK293T细胞，获得高滴度的病毒后，分别对普通的人皮肤成纤维细胞转染NR5A1慢病毒和空载病毒，转染效率分别可达到60-90％和90-100％；(三)小分子诱导将病毒转染后的皮肤成纤维细胞培养3-4天，使用普通培养液培养，配方是：10％胎牛血清+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基；之后将培养液更换为在普通培养液中添加小分子化合物后组成的信号分子诱导液，继续培养7-14天。信号分子诱导液的配方是：10％胎牛血清+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基+10μMForskolin+5μMDAPT+0.1μMPurmorphamine，此后每隔2～3天更换一次信号分子诱导液，持续诱导7天以上；其后的细胞培养，一直使用信号分子诱导液维持；(四)睾酮分泌功能鉴定取诱导后的细胞培养上清液，用化学发光法测定睾酮浓度。本专利技术的有益效果在于，本专利技术方法能简单、快速地将人皮肤成纤维细胞转分化为功能性Leydig样细胞，它可以分泌睾酮，有助于治疗男性性腺功能低下症。并且，本专利技术所诱导的Leydig样细胞是由人皮肤细胞通过转录因子NR5A1的表达及小分子化合物直接重编程而得，不经过干细胞阶段，避免移植时成瘤风险。附图说明图1为本专利技术人皮肤成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法示意图。图2本专利技术人皮肤成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的鉴定，A.正常人皮肤成纤维细胞的培养形态；B.转分化为Leydig样细胞的细胞形态；C.睾酮分泌功能鉴定。具体实施方式以下，结合具体实施方式对本专利技术的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本专利技术，而非对本专利技术的限制。本专利技术利用NR5A1基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法，其特征在于，所述方法为利用NR5A1基因的表达及小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞，所述小分子化合物为Forskolin、DAPT和Purmorphamine的混合物。/n

【技术特征摘要】
20190307 CN 20191017336761.一种诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法，其特征在于，所述方法为利用NR5A1基因的表达及小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞，所述小分子化合物为Forskolin、DAPT和Purmorphamine的混合物。


2.根据权利要求1所述的一种诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法，其特征在于，所述方法为先构建携带NR5A1的慢病毒转染人皮肤成纤维细胞，使正常人皮肤成纤维细胞表达NR5A1，将病毒转染后的皮肤成纤维细胞放置在普通培养液中培养3-4天，待NR5A1稳定表达后，更换为信号分子诱导液再培养，7-14天后可诱导为Leydig样细胞，所述信号分子诱导液是在普通培养液中加入Forskolin、DAPT和Purmorphamine三种物质组成的。


3.根据权利要求2所述的一种诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法，其特征在于，所述普通培养液配方是，10％胎牛血清+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基，在37℃，5％CO2环境下培养细胞。


4.根据权利要求2所述的一种诱导人成纤维细胞重编程为Leydig样细胞的方法，其特征在于，所述信号分子诱导液是在普通培养液中加入10μMForskolin、5μMDAPT和0.1μMPurmorphamine三种物质组成的。


5.根据权利要求1所述的一种诱导人成纤维细胞重编程为Le...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙杰，周瑾，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心，
类型：发明
国别省市：上海;31