负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料及制备方法及在制备治疗骨质疏松骨折材料中的应用技术

本发明专利技术公开了负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料及制备方法及在制备治疗骨质疏松骨折材料中的应用，制备方法为：(1)配制I型胶原蛋白溶液，装进截留分子量为1000Da的透析袋中；(2)向氯化钙水溶液中，加入磷酸和氢氧化钠，搅拌均匀，得透析膜外溶液；(3)将透析袋放入步骤(2)获得的透析膜外溶液中，在10℃～40℃的环境下搅拌0.5h‑24h，取出透析袋，过滤，得到胶原基骨修复材料，将所述胶原基骨修复材料与小干扰RNA进行混合，得到负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料；本发明专利技术以胶原基骨修复材料作为小干扰RNA的载体，一方面透过基因层面刺激骨形成，另一方面通过胶原基骨修复材料的填充作用修复断骨。

【技术实现步骤摘要】
负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料及制备方法及在制备治疗骨质疏松骨折材料中的应用
本专利技术涉及负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料及制备方法及在制备治疗骨质疏松骨折材料中的应用。
技术介绍
1998年，AndrewZ.Fire和CraigC.Mello共同发现了体内RNA干扰的作用机制，并于2006年共同获得了诺贝尔生理医学奖。从而为抵抗病毒、癌症等严重疾病的新一代药物(小RNA干扰类药物)的研发开启了一扇大门。因此小RNA干扰类药物具有作用方式新颖、作用机制明确、靶向性强和副作用小等优点。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(genesilencing)，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。骨质疏松症是一个全球性的医疗保健问题，其社会经济负担日益增加。它是由骨形成性成骨细胞和骨吸收性破骨细胞之间的不平衡所引起的。目前，治疗骨质疏松症的两种主要方法如下：第一是通过合成代谢剂(例如甲状旁腺激素)刺激骨形成；第二则是通过抗骨吸收因子来预防骨吸收(例如双膦酸盐，降钙素，雷洛昔芬和雌激素)。硬化蛋白(Sclerostin)是一种由骨细胞分泌的蛋白质，可抑制骨形成。硬化蛋白是成骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂，因此作为成骨细胞分化和功能的负调节剂。据报道，小鼠和人硬化蛋白缺失均诱导高骨量表型，而在转基因小鼠模型中过度表达硬化蛋白基因会导致骨量减少。这些表明硬化蛋白与骨量之间呈反比关系。骨修复材料基本上以同种骨、异种骨、陶瓷植入材料、医用高分子材料等为原料。科学研究证明，人类骨骼的主要成分是Ⅰ型胶原蛋白和羟基磷灰石。如果把自体骨中的细胞和免疫原等个性化成分剔除后,可以说天然的骨基质就是最好的骨修复材料。但是在体外将有机相和无机相简单的复合成骨基质材料并不理想,原料的结晶度和复合所需的环境均不能满足最终产品形成的要求,所制备的产品在结构上也是杂乱的。这正是仿生材料工艺上的难点。胶原基骨修复材料(专利号CN102874782B)通过胶原与钙离子在体外自组装而成,其生产的原料来源丰富,产品无疾病传染的风险、无抗原性,生物相容性好,从而有效的克服了现有材料的缺陷,为临床骨修复提供了一种安全、有效的选择。该材料具有一定的孔隙，可以吸附小分子药物共同发挥骨修复的作用。但是该修复材料仅具有填充骨缺损，起到骨支撑的功效，不能调节成骨细胞和破骨细胞之间的不平衡，因此不能刺激骨形成和加速骨修复。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料。本专利技术的第二个目的是提供一种负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供一种负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料在制备治疗骨质疏松骨折材料中的应用。本专利技术的技术方案概述如下：负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料的制备方法，是包括如下步骤：(1)以浓度为0.01mol/L-0.5mol/L的盐酸水溶液为溶剂，配制质量浓度为0.1％-15.0％的I型胶原蛋白溶液，装进截留分子量为1000Da的透析袋中；(2)向浓度为0.01mol/L-5.0mol/L的氯化钙水溶液中，加入磷酸和氢氧化钠，搅拌均匀，得透析膜外溶液，所述透析膜外溶液中钙磷离子摩尔比为1.67:1，氯化钙与氢氧化钠的质量比为1:(0.1-10)；(3)按I型胶原蛋白与氯化钙的质量比为1:(0.1-10)的比例，将步骤(1)获得的透析袋放入步骤(2)获得的透析膜外溶液中，在10℃～40℃的环境下搅拌0.5h-24h，取出透析袋，将透析袋内的白色液体经过0.45μm滤膜过滤，得到胶原基骨修复材料，将所述胶原基骨修复材料与小干扰RNA进行混合，胶原基骨修复材料的孔结构吸附小干扰RNA，得到负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料，所述胶原基骨修复材料与小干扰RNA的比为1g:120μg；小干扰RNA的核酸序列选自下述三种之一种：第一种：SEQIDNo.1所示正义链5’-GCCUUCAAGAAUGAUGCCATT-3’，SEQIDNo.4所示反义链5’-UGGCAUCAUUCUUGAAGGCTT-3’；第二种：SEQIDNo.2所示正义链5’-CUUCAAGAAUGAUGCCACATT-3’，SEQIDNo.5所示反义链5’-UGUGGCAUCAUUCUUGAAGTT-3’；第三种SEQIDNo.3所示正义链5’-CUCAGGAACUAGAGAACAATT-3’，SEQIDNo.6所示反义链5’-UUGUUCUCUAGUUCCUGAGTT-3’。上述方法制备的负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料。上述负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料在制备治疗骨质疏松骨折材料中的应用。本专利技术的优点：本专利技术以胶原基骨修复材料作为小干扰RNA的载体，其负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料一方面透过基因层面刺激骨形成，另一方面通过胶原基骨修复材料的填充作用修复断骨。附图说明图1显示复合物1-3植入大鼠股骨断处能有效抑制硬化蛋白mRNA的表达，与对照组相比，mRNA明显下降。图2显示复合物1-3能够有效促进骨愈合，与对照组相比明显缩短骨间隙。图3显示复合物1-3能有效增加大鼠断骨的固含量。图4显示复合物4-5抑制骨组织中硬化蛋白mRNA的表达效果与实施例1比较。具体实施方式I型胶原蛋白(市售)。小干扰RNA由广州市锐博生物科技有限公司合成。磷酸(市售)。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：(1)以浓度为0.1mol/L的盐酸水溶液为溶剂，配制质量浓度为1％的I型胶原蛋白溶液，装进截留分子量为1000Da的透析袋中；(2)向浓度为1.0mol/L的氯化钙水溶液中，加入磷酸和氢氧化钠，搅拌均匀，得透析膜外溶液，所述透析膜外溶液中钙磷离子摩尔比为1.67:1，氯化钙与氢氧化钠的质量比为1:1；(3)按I型胶原蛋白与氯化钙的质量比为1:1的比例，将步骤(1)获得的透析袋放入步骤(2)获得的透析膜外溶液中，在25℃的环境下搅拌12h，取出透析袋，将透析袋内的白色液体经过0.45μm滤膜过滤，得到胶原基骨修复材料，将所述胶原基骨修复材料与小干扰RNA进行混合，胶原基骨修复材料的孔结构吸附小干扰RNA，得到负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料，所述胶原基骨修复材料与小干扰RNA的比为1g:120μg；小干扰RNA的核酸序列为：SEQIDNo.1所示正义链5’-GCCUUC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料的制备方法，其特征是包括如下步骤：/n(1)以浓度为0.01mol/L-0.5mol/L的盐酸水溶液为溶剂，配制质量浓度为0.1％-15.0％的I型胶原蛋白溶液，装进截留分子量为1000Da的透析袋中；/n(2)向浓度为0.01mol/L-5.0mol/L的氯化钙水溶液中，加入磷酸和氢氧化钠，搅拌均匀，得透析膜外溶液，所述透析膜外溶液中钙磷离子摩尔比为1.67:1，氯化钙与氢氧化钠的质量比为1:(0.1-10)；/n(3)按I型胶原蛋白与氯化钙的质量比为1:(0.1-10)的比例，将步骤(1)获得的透析袋放入步骤(2)获得的透析膜外溶液中，在10℃～40℃的环境下搅拌0.5h-24h，取出透析袋，将透析袋内的白色液体经过0.45μm滤膜过滤，得到胶原基骨修复材料，将所述胶原基骨修复材料与小干扰RNA进行混合，胶原基骨修复材料的孔结构吸附小干扰RNA，得到负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料，所述胶原基骨修复材料与小干扰RNA的比为1g:120μg；/n小干扰RNA的核酸序列选自下述三种之一种：/n第一种：SEQ ID No.1所示正义链5’-GCCUUCAAGAAUGAUGCCATT-3’，SEQ ID No.4所示反义链5’-UGGCAUCAUUCUUGAAGGCTT-3’；/n第二种：SEQ ID No.2所示正义链5’-CUUCAAGAAUGAUGCCACATT-3’，SEQ ID No.5所示反义链5’-UGUGGCAUCAUUCUUGAAGTT-3’；/n第三种SEQ ID No.3所示正义链5’-CUCAGGAACUAGAGAACAATT-3’，SEQ ID No.6所示反义链5’-UUGUUCUCUAGUUCCUGAGTT-3’。/n...

【技术特征摘要】
1.负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)以浓度为0.01mol/L-0.5mol/L的盐酸水溶液为溶剂，配制质量浓度为0.1％-15.0％的I型胶原蛋白溶液，装进截留分子量为1000Da的透析袋中；
(2)向浓度为0.01mol/L-5.0mol/L的氯化钙水溶液中，加入磷酸和氢氧化钠，搅拌均匀，得透析膜外溶液，所述透析膜外溶液中钙磷离子摩尔比为1.67:1，氯化钙与氢氧化钠的质量比为1:(0.1-10)；
(3)按I型胶原蛋白与氯化钙的质量比为1:(0.1-10)的比例，将步骤(1)获得的透析袋放入步骤(2)获得的透析膜外溶液中，在10℃～40℃的环境下搅拌0.5h-24h，取出透析袋，将透析袋内的白色液体经过0.45μm滤膜过滤，得到胶原基骨修复材料，将所述胶原基骨修复材料与小干扰RNA进行混合，胶原基骨修复材料的孔结构吸附小干扰RNA，得到负载小干扰RNA的胶原基骨修复材料，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤涛，李刚，邓艳，林思恩，宋艺，黄志超，万力，毕宏伟，
申请(专利权)人：深圳市百吉因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44