能够复制的腺病毒载体制造技术

提供了用于递送外源免疫原的能够复制的猿猴腺病毒载体。本发明专利技术的载体展示外源免疫原的优异复制和表达。它们可用作预防性和治疗性疫苗以及可用于基因疗法中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】能够复制的腺病毒载体序列表本申请含有已经以ASCII形式电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述ASCII拷贝，在2018年9月28日创建，命名为VU66430_WO_SL.txt，且大小为100,598字节。专利
本专利技术处于重组腺病毒的领域中。其提供了分离的能够复制的腺病毒载体、重组多核苷酸、多肽、载体和包含多核苷酸和多肽序列的组合物。专利技术背景由于它们的大转基因能力和在各种靶标组织中实现高度有效基因转移的能力，人腺病毒已被广泛用于基因转移应用。重组腺病毒可用于基因疗法中和可用作疫苗。基于猿猴腺病毒的病毒载体可以提供人来源的腺病毒载体用于开发基于核酸的疫苗的用途的替代方案。大多数人暴露于人腺病毒并发展对人腺病毒的免疫力。需要有效地将分子递送至靶标并使预先存在的对人腺病毒血清型的免疫力的影响最小化的载体。猿猴腺病毒在这方面是有效的；它们与人病毒足够密切相关，以有效地诱导对递送的外源性抗原的免疫力，人对所述递送的外源性抗原几乎没有预先存在的免疫力或没有预先存在的免疫力。复制缺陷的腺病毒将其基因组递送至细胞的内部，并且因为它们不复制，所以不扩增转基因有效载荷。通常，E1基因被包含选择的启动子和对应于一个或多个目标基因的核酸序列的转基因盒替换，产生复制缺陷的重组病毒。与复制缺陷的腺病毒不同，能够复制的腺病毒复制其DNA和其转基因，因此在大得多的程度上扩增其转基因表达。能够复制的腺病毒具有更大功效的潜能，但它们造成传播和感染家庭成员或健康护理工作人员的风险。尽管存在潜在的安全性问题，但能够复制的人腺病毒已成功用于针对呼吸道疾病进行免疫。将几十万的美国新兵用配制为肠溶包衣的胶囊或片剂的全病毒人Ad4、Ad7和Ad21的活的未减毒分离株针对急性呼吸道疾病进行有效且安全地接种疫苗(CancerGeneTherapy(2004)11:819)。已经描述了人和犬的能够复制的载体(Vaccine(2002)20:3485)，然而，尚未发现猿猴的能够复制的腺病毒载体能够递送免疫原或治疗剂用于预防或治疗疾病。这种载体将组合有效的能够复制的载体的优点与猿猴腺病毒的优点。同样，尽管猿猴载体具有在人细胞中复制的能力，但它们的复制没有在猿猴细胞中那么好，因此它们的功效与猿猴中的功效相比减弱。因此，在本领域中需要组合有效复制和在人中没有预先存在的免疫力的优点的载体。专利技术概述与复制缺陷的猿猴腺病毒载体相比，本专利技术的能够复制的猿猴腺病毒载体生成更强的基于基因的疫苗应答。已经对本专利技术的载体进行优化，以提供改进的体内功效，同时维持适合于人免疫的安全性谱。它们具有固有地强的免疫调节性骨架和能够驱动强且持续的转基因表达的启动子。本专利技术的能够复制的载体可用作免疫原性组合物的组分，其用于诱导受试者中的免疫应答，其在治疗中的使用方法和制造方法。本专利技术提供了能够复制的猿猴腺病毒载体，其含有包含启动子和转基因的表达盒，其中所述表达盒被插入载体的E3区域、HE1位点或HE2位点中。本专利技术还提供了使用这种能够复制的猿猴腺病毒载体在有此需要的受试者中诱导针对由病原体引起的疾病的免疫应答的方法。在一个实施方案中，所述猿猴是黑猩猩。所述载体可以是ChAd155或ChAd83。能够复制的黑猩猩腺病毒可以进一步包含编码黑猩猩腺病毒纤突多肽或其功能衍生物和/或黑猩猩腺病毒E4区域的核苷酸序列。所述启动子可以选自CASI启动子和增强的巨细胞病毒启动子。在一些实施方案中，所述表达盒可以进一步包含转录后调节元件。在一个实施方案中，所述转录后调节元件是土拨鼠肝炎转录后调节元件。所述转基因可以是抗原。所述抗原可以选自狂犬病病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、人免疫缺陷病毒抗原、结核病抗原、疟疾抗原、丙型肝炎病毒抗原、基孔肯雅病抗原和乙型肝炎病毒抗原。附图描述图1：能够复制的猿猴腺病毒构建体。反向末端重复(ITR)侧接3'和5'末端；E1是早期基因1；CMV是巨细胞病毒启动子；CASI是CASI启动子；RG是模型抗原，WPRE是土拨鼠肝炎转录后调节元件，∆E3表示早期基因3被缺失；纤突表示编码纤突蛋白的腺病毒基因，且E4是早期基因4。通过插入转基因表达盒替代腺病毒基因组的E3区域(“RC1”)(顶部小图)，将转基因表达盒插入HE1区域中，即，在纤突基因的终止密码子和E4区域之间(中间小图)，或通过将转基因表达盒插入HE2区域中，即在右ITR的下游(“RC2”)(底部小图)来构建能够复制的猿猴腺病毒载体。图2：在原代人细胞系中产生表达RC1和RC2载体的能够复制的ChAd155和ChAd83。条形代表每个细胞表达的病毒颗粒的数目。图3：在原代人细胞系中，表达RC1和RC2载体的能够复制的ChAd155和ChAd83的总病毒基因组拷贝数。条形代表每个细胞的载体基因组拷贝数。图4：在250和1250的感染复数下，通过原代人细胞系的ChAd155复制缺陷的(RD)和能够复制的(RC1和RC2)载体的表达水平。所述载体表达狂犬病糖蛋白转基因(51kDa)，其由western印迹所证明。左小图显示感染后第2天的表达，且右小图显示感染后第7天的表达。图5：在250和1250的感染复数下，通过原代人细胞系的ChAd83复制缺陷的(RD)和能够复制的(RC1和RC2)载体的表达水平。所述载体表达狂犬病糖蛋白转基因(51kDa)，其由western印迹所证明。右小图显示感染后第2天的表达，且底部小图显示感染后第7天的表达。图6：在鼠细胞系NMuLi(顶部小图)和Vero非人灵长类细胞系(底部小图)中，表达RC1和RC2载体的能够复制的ChAd155和表达RC1和RC2载体的能够复制的ChAd83的病毒基因组拷贝数。以50和250的感染复数感染细胞。图7：在鼠细胞系中表达模型狂犬病糖蛋白(RG)转基因的ChAd155RC1和RC2载体的表达水平的比较，其由在感染后两天和五天的western印迹所证明(顶部小图)。在鼠细胞系中表达模型狂犬病糖蛋白(RG)转基因的ChAd155RC1和RC2载体与ChAd83RC1和RC2载体的表达水平的比较，其由感染后两天和五天的western印迹所证明(底部小图)。以50、250和1250的感染复数感染细胞。图8：表达模型蛋白转基因的复制缺陷的ChAd155(RD)，ChAd155RC1和ChAd83RC1载体在小鼠中的免疫原性，其通过IFN-γELISpot所测量并表示为每106个脾细胞的斑点形成细胞。图9：小鼠中针对口服和肌肉内(IM)递送的表达模型狂犬病糖蛋白蛋白转基因的ChAd155RD和ChAd155RC1的中和抗体(顶部小图)和T细胞(底部小图)应答。顶部小图显示针对狂犬病感染的中和抗体保护，其用荧光抗体病毒中和测定法(FAVN)测量。虚线指示保护阈值。底部小图显示狂犬病特异性T细胞应答，其通过干扰素γELIspot测定法测量。序列的注释SEQIDNO:1–编码野生型ChAd本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.能够复制的猿猴腺病毒载体，其含有包含启动子和转基因的表达盒，其中所述表达盒被插入所述载体的E3区域、HE1位点或HE2位点中。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171016 US 62/5729271.能够复制的猿猴腺病毒载体，其含有包含启动子和转基因的表达盒，其中所述表达盒被插入所述载体的E3区域、HE1位点或HE2位点中。


2.权利要求1的能够复制的猿猴腺病毒载体，其中所述猿猴是黑猩猩。


3.权利要求1的能够复制的黑猩猩腺病毒载体，其进一步包含编码黑猩猩腺病毒纤突多肽或其功能衍生物和/或黑猩猩腺病毒E4区域的核苷酸序列。


4.权利要求1的能够复制的猿猴腺病毒载体，其中所述载体是在人中具有低血清阳性率的腺病毒。


5.权利要求4的能够复制的猿猴腺病毒载体，其中所述载体是ChAd155。


6.权利要求4的能够复制的猿猴腺病毒载体，其中所述载体是ChAd83。


7.权利要求1的能够复制的猿猴腺病毒载体，其中所述启动子选自CASI启动子和增强的巨细胞病毒启动子。


8.权利要求7的能够复制的猿猴腺病毒载体，其中所述启动子是CASI启动子。


9.权利要求7的能够复制的猿猴腺病毒载体，其中所述启动子是增强的巨细胞病毒启动子。


10.权利要求1的能够复制的猿猴腺病毒载体，其中所述表达盒进一步包含转录后调节元件。


11.权利要求10的能够复制的猿猴腺病毒载体，其中所述转录后调节元件是土拨鼠肝炎转录后调节元件。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：V阿门多拉，S科罗卡，A维特利，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE