内源性T细胞受体的靶向置换制造技术

本文提供了用于编辑人T细胞基因组的组合物和方法。在一些实施方式中，将异源性T细胞受体(TCR)‑β链和异源性TCR‑α链插入T细胞基因组中TCR亚基恒定基因的外显子1。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】内源性T细胞受体的靶向置换在先相关申请本申请要求2017年10月27日提交的第62/578,153号美国临时申请的优先权，该临时申请通过引用整体纳入本文。
技术介绍
T细胞是过继性细胞疗法发展领域中研究最活跃的细胞类型。T细胞与T细胞受体(TCR)的靶标特异性相互作用，从而实现高度特异性的反应，且副作用极小。通过将具有所需特异性的新受体插入T细胞，可以针对新型抗原和靶标就这些高度有效且特异性的反应进行工程改造。然而，开发完全新型的受体是费时，昂贵的，并且不能利用这样的事实，即通过开发内源性T细胞库，机体自然产生结合几乎任何可能的抗原靶标的TCR。获得人类T细胞并将其内源性TCR置换为具有所需抗原特异性的TCR的能力可能在过继T细胞疗法的开发和应用中具有变革性。专利技术概述本公开涉及用于编辑人T细胞的基因组的组合物和方法。专利技术人发现，异源性TCR可以插入T细胞基因组中的靶向的区域中，使得异源性TCR处于内源性TCR启动子的控制之下。本文提供的方法和组合物可用于用具有所需抗原特异性的异源性TCR置换人T细胞中的内源性TCR。在一些实施方式中，T细胞基因组中的靶向的区域是天然T细胞受体基因座。在一些实施方式中，本公开提供了编辑人T细胞的基因组的方法。在一些实施方式中，该方法包括将核酸序列插入人T细胞中T细胞受体(TCR)-亚基恒定基因的外显子1的靶区域中，该核酸序列从N端到C端编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)第一异源性TCR亚基链，其中TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；(iii)第二自切割肽序列；(iv)第二异源性TCR亚基链的可变区；和(v)内源性TCR亚基的N端的部分，其中，如果内源性TCR亚基为TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，则第一异源性TCR亚基链为异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链并且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链，并且其中，如果内源性TCR亚基是TCR-β亚基，则第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链并且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。在一些实施方式中，该方法包括将核酸序列插入人T细胞中TCRα亚基恒定基因(TRAC)的外显子1的靶区域中，该核酸序列从N端到C端的编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)异源性TCR-β链；(iii)第二自切割肽序列；(iv)异源性TCR-α链的可变区；和(v)内源性TCR-α亚基的N端的部分。在一些实施方式中，该方法包括将核酸序列插入人T细胞中TCR-β亚基恒定基因(TRBC)的外显子1的靶区域中，该核酸序列从N端到C端编码：(i)第一自切割肽序列；(ii)异源性TCR-α链；(iii)第二自切割肽序列；(iv)异源性TCR-β链的可变区；和(v)内源性TCR-β亚基的N端的部分。在一些实施方式中，通过将包含所述核酸的病毒载体引入T细胞来插入所述核酸。在一些实施方式中，通过将包含所述核酸的非病毒载体引入T细胞来插入所述核酸。在一些实施方式中，通过向T细胞中引入以下来将核酸插入T细胞中：(a)切割TCR-α亚基恒定基因(TRAC)的外显子1中的靶区域以在T细胞的基因组中产生插入位点的靶向的核酸酶；和(b)核酸序列，其中所述核酸序列通过同源性定向修复(HDR)掺入插入位点。在一些实施方式中，通过向T细胞中引入以下来将核酸插入T细胞中：(a)切割TCR-β亚基恒定基因(TRBC)的外显子1中的靶区域以在T细胞的基因组中产生插入位点的靶向的核酸酶；和(b)核酸序列，其中所述核酸序列通过同源性定向修复(HDR)掺入插入位点。在一些实施方式中，核酸的5′末端和3′末端包含与侧接靶区域的基因组序列同源的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸的5′末端和3′末端包含与侧接插入位点的基因组序列同源的核苷酸序列。在一些实施方式中，靶向的核酸酶在插入位点引入双链断裂。在一些实施方式中，将核酸序列作为双链或单链核酸引入细胞中。在一些实施方式中，将核酸作为双链或单链DNA模板引入细胞中。在一些实施方式中，将核酸序列作为线性核酸引入细胞。在一些实施方式中，第一自切割肽和第二自切割肽是相同或不同的病毒2A肽。在一些实施方式中，靶向的核酸酶选自RNA向导的核酸酶结构域，转录激活物样效应核酸酶(TALEN)，锌指核酸酶(ZFN)和megaTAL。在一些实施方式中，RNA向导的核酸酶是Cpf1核酸酶或Cas9核酸酶，并且该方法进一步包括将与TRAC的外显子1中的靶区域特异性杂交的向导RNA引入细胞中。在一些实施方式中，将Cpf1核酸酶或Cas9核酸酶，向导RNA和核酸作为核糖核蛋白复合物(RNP)-DNA模板复合物引入细胞中，其中RNP-DNA模板复合物包含：(i)RNP，其中RNP包含Cpf1核酸酶或Cas9核酸酶，和向导RNA；以及(ii)DNA模板。在一些实施方式中，复合物中RNP与DNA模板的摩尔比为约3∶1至约100∶1。在一些实施方式中，通过用DNA模板与RNP在约20°-25℃的温度孵育约10-30分钟形成RNP-DNA模板复合物。在一些实施方式中，在将RNP-DNA模板复合物导入细胞之前混合RNP-DNA模板复合物和细胞。在一些实施方式中，RNP-DNA模板复合物包含至少2种结构不同的RNP复合物。在一些实施方式中，至少两种结构不同的RNP复合物包含结构不同的向导RNA。在一些实施方式中，所述结构不同的RNP复合物各自包含Cas9切口酶，并且其中所述结构不同的向导RNA杂交至所述靶区域的相对链。在一些实施方式中，引入包括电穿孔。在一些实施方式中，将核酸引入约1×105至约2×106个T细胞的群。在一些实施方式中，将靶向的核酸酶和DNA模板引入约1×105至约2×106个T细胞的群。在一些实施方式中，将至少两种结构不同的DNA模板引入细胞。在一些实施方式中，至少两种结构不同的DNA模板是非病毒模板。在一些实施方式中，至少两种结构不同的DNA模板中的每一个编码抗原特异性T细胞受体的异源性TCR-β链的可变区和抗原特异性T细胞受体的异源性TCR-α链的可变区的独特组合。在一些实施方式中，T细胞是调节T细胞、效应T细胞或原初T细胞。在一些实施方式中，T细胞是效应T细胞，并且其中效应T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方式中，T细胞是效应T细胞，并且其中效应T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方式中，效应T细胞是CD4+CD8+T细胞。在一些实施方式中，该方法进一步包括在允许异源性TCR-β链和异源性TCR-α链表达以形成抗原特异性T细胞受体的条件下培养T细胞。在一些实施方式中，该方法进一步包括在有效扩增修饰细胞群的条件下培养修饰的T细胞。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化表达抗原特异性T细胞受体的T细胞。在一些实施方式中，本公开提供了编辑人T细胞的基因组的方法，其包括：(a)将第一核酸序列插入人T细胞中TCRα亚基恒定基因(TRAC)的外显子1的靶区域中，该第一核酸序列从N端到C端编码：(i)自切割肽序列；(ii)抗原特异性T细胞受体的异源性TCR-α链；和(iii)内源性TCRα亚基外显子1的N端的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编辑人T细胞基因组的方法，所述方法包括将以下插入人T细胞中T细胞受体(TCR)-亚基恒定基因的外显子1的靶区域中，/n核酸序列，其从N端到C端编码，/n(i)第一自切割肽序列；/n(ii)第一异源性TCR亚基链，其中所述TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；/n(iii)第二自切割肽序列；/n(iv)第二异源性TCR亚基链的可变区；和/n(v)内源性TCR亚基的N端的部分，其中，如果内源性TCR亚基为TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，则第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链并且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链，并且其中，如果内源性TCR亚基是TCR-β亚基，则第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链并且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171027 US 62/578,1531.一种编辑人T细胞基因组的方法，所述方法包括将以下插入人T细胞中T细胞受体(TCR)-亚基恒定基因的外显子1的靶区域中，
核酸序列，其从N端到C端编码，
(i)第一自切割肽序列；
(ii)第一异源性TCR亚基链，其中所述TCR亚基链包含TCR亚基的可变区和恒定区；
(iii)第二自切割肽序列；
(iv)第二异源性TCR亚基链的可变区；和
(v)内源性TCR亚基的N端的部分，其中，如果内源性TCR亚基为TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，则第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链并且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链，并且其中，如果内源性TCR亚基是TCR-β亚基，则第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链并且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸序列从N端到C端编码，
(i)第一自切割肽序列；
(ii)异源性TCR-β链；
(iii)第二自切割肽序列；
(iv)异源性TCR-α链的可变区；和
(v)内源性TCR-α亚基的N端的部分，所述核酸序列被插入人T细胞中TCR-α亚基恒定基因(TRAC)的外显子1。


3.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸序列从N端到C端编码，
(i)第一自切割肽序列；
(ii)异源性TCR-α链；
(iii)第二自切割肽序列；
(iv)异源性TCR-β链的可变区；和
(v)内源性TCR-β亚基的N端的部分，所述核酸序列被插入人T细胞中TCR-β亚基恒定基因(TRBC)的外显子1。


4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述核酸序列是双链或单链核酸序列，并且其中所述核酸序列通过将所述核酸序列引入T细胞被插入。


5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核酸通过将包含所述核酸的病毒载体引入T细胞被插入。


6.如权利要求1、2、4或5中任一项所述的方法，其中所述核酸通过将以下引入T细胞被插入，
(a)切割TRAC基因的外显子1中的靶区域以在T细胞的基因组中产生插入位点的靶向的核酸酶；和
(b)核酸序列，其中所述核酸序列通过同源性定向修复(HDR)插入插入位点。


7.如权利要求1、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述核酸通过将以下引入T细胞被插入，
(a)切割TRBC基因的外显子1中的靶区域以在T细胞的基因组中产生插入位点的靶向的核酸酶；和
(b)核酸序列，其中所述核酸序列通过同源性定向修复(HDR)插入插入位点。


8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述核酸序列的5′末端和3′末端包含与侧接靶区域的基因组序列同源的核苷酸序列。


9.如权利要求8所述的方法，其中所述核酸序列的5′末端和3′末端包含与侧接插入位点的基因组序列同源的核苷酸序列。


10.如权利要求6-9中任一项所述的方法，其中所述靶向的核酸酶在插入位点引入双链断裂。


11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述核酸序列是单链DNA模板。


12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述核酸序列是线性DNA模板。


13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第一自切割肽和所述第二自切割肽是相同或不同的病毒2A肽。


14.如权利要求6-13中任一项所述的方法，其中所述靶向的核酸酶选自RNA向导的核酸酶结构域，转录激活物样效应核酸酶(TALEN)，锌指核酸酶(ZFN)和megaTAL。


15.如权利要求14所述的方法，其中所述RNA向导的核酸酶是Cpf1核酸酶或Cas9核酸酶，并且所述方法还包括将与TRAC的外显子1中的靶区域特异性杂交的向导RNA引入细胞中。


16.如权利要求14所述的方法，其中所述RNA向导的核酸酶是Cpf1核酸酶或Cas9核酸酶，并且所述方法还包括将与TRBC的外显子1中的靶区域特异性杂交的向导RNA引入细胞中。


17.如权利要求15或16所述的方法，其中将Cpf1核酸酶或Cas9核酸酶，向导RNA和核酸作为核糖核蛋白复合物(RNP)-DNA模板复合物引入细胞中，其中所述RNP-DNA模板复合物包含：
(i)RNP，其中RNP包含Cpf1核酸酶或Cas9核酸酶，和向导RNA；和
(ii)DNA模板。


18.如权利要求17所述的方法，其中所述复合物中RNP与DNA模板的摩尔比为约3∶1至约100∶1。


19.如权利要求17或18所述的方法，其中通过用所述DNA模板与所述RNP在约20°-25℃的温度孵育约10分钟至约30分钟形成所述RNP-DNA模板复合物。


20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中在将所述RNP-DNA模板复合物导入所述细胞之前，混合所述RNP-DNA模板复合物和所述细胞。


21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述RNP-DNA模板复合物包含至少两种结构不同的RNP复合物。


22.如权利要求21所述的方法，其中所述至少两种结构不同的RNP复合物包含结构不同的向导RNA。


23.如权利要求22所述的方法，其中所述结构不同的RNP复合物各自包含Cas9切口酶，并且其中所述结构不同的向导RNA杂交至所述靶区域的相对链。


24.如权利要求4-23中任一项所述的方法，其中所述引入包括电穿孔。


25.如权利要求4-24中任一项所述的方法，其中将所述核酸或所述RNP：DNA模板复合物引入约1×105至约2×106个T细胞。


26.如权利要求25所述的方法，其中所述至少两种结构不同的DNA模板被引入细胞。


27.如权利要求26所述的方法，其中所述至少两种结构不同的DNA模板中的每一个编码抗原特异性T细胞受体的异源性TCR-β链的可变区和抗原特异性T细胞受体的异源性TCR-α链的可变区的独特组合。


28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述T细胞是调节T细胞、效应T细胞或原初T细胞。


29.如权利要求28所述的方法，其中所述T细胞是效应T细胞，并且其中所述效应T细胞是CD8+T细胞或CD4+细胞。


30.如权利要求29所述的方法，其中所述效应T细胞是CD4+CD8+T细胞。


31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，还包括在允许异源性TCR-β链和异源性TCR-α链表达以形成抗原特异性T细胞受体的条件下培养T细胞。


32.如权利要求31所述的方法，还包括在有效扩增修饰细胞群的条件下培养修饰的T细胞。


33.如权利要求31或32所述的方法，还包括纯化表达抗原特异性T细胞受体的T细胞。


34.一种通过权利要求1-33中任一项所述的方法产生的修饰的T细胞。


35.一种包含核酸序列的修饰的T细胞，所述核酸序列从N端到C端编码，
(i)第一自切割肽序列；
(ii)第一异源性TCR亚基链；
(iii)第二自切割肽序列；
(iv)第二异源性TCR亚基链的可变区；和
(v)内源性TCR亚基的N端的部分，其中，如果内源性TCR亚基为TCR-α(TCR-阿尔法)亚基，则第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-β(TCR-贝塔)亚基链并且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链，并且其中，如果内源性TCR亚基是TCR-β亚基，则第一异源性TCR亚基链是异源性TCR-α亚基链并且第二异源性TCR亚基链是异源性TCR-β亚基链。


36.如权利要求35所述的修饰的T细胞，其中所述核酸序列从N端到C端编码，
(i)第一自切割肽序列；
(ii)异源性T细胞受体(TCR)-β链；
(iii)第二自切割肽序列；
(iv)异源性TCR-α链的可变区；和
(v)内源性TCR-α亚基的N端的部分，
其中核酸序列被整合到TRAC基因的外显子1中。


37.如权利要求35所述的修饰的T细胞，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·L·罗斯，E·士夫洛特，A·曼森，C·P·召司，A·力巴斯，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US