在组蛋白去乙酰化酶抑制剂存在下再生植物制造技术

本发明专利技术涉及植物育种领域，尤其涉及由细胞和其它组织进行植物再生。更具体地，本发明专利技术提供了使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂改善愈伤组织形成和由愈伤组织进行的植物再生的方法和手段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在组蛋白去乙酰化酶抑制剂存在下再生植物
本专利技术涉及植物育种领域，尤其涉及由细胞和其它组织再生植物。更具体地，本专利技术提供了使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂改善愈伤组织形成和由愈伤组织再生植物的方法和手段。专利技术背景植物再生包括细胞、组织和器官在限定的物理和化学条件下进行体外培养。植物中的再生很早便是公知的。在植物中，分化的细胞能够在适当的培养条件下再生为完整的组织阵列。再生可涉及直接或间接器官形成。在直接再生中，由外植体组织直接诱导出体外器官；在间接再生中，通常由中间组织愈伤组织形成新生器官。植物愈伤组织是可以产生新组织的未分化的结构。通过用不同比例的激素对其进行处理，可以由生长的愈伤组织不同地诱发出植物叶、芽、根和胚。通常，在整个植物再生过程中可以识别出三个阶段。首先，外植体组织的体细胞可以响应激素信号，以获得与分生细胞类似的特征，这一过程称为“去分化”。其次，对具有器官生成能力的愈伤组织细胞进行重新编程，并在激素平衡的影响下确定特定器官的形成。第三再生阶段是形态发育，其与外源供应激素无关。因此，外源激素治疗是触发体外再生早期发育事件的关键因素。然而，对于许多植物而言，获得可以再生为完整植物的去分化细胞(愈伤组织)并不总是可行的。众所周知，甜菜难以进行去分化和植物再生。这些困难是例如通过农杆菌介导转化程序获得转基因甜菜的主要障碍。几十年来，育种者和研究人员一直在致力于研发更有效的方案，以转化和再生愈伤组织形成困难(recalcitrant)的植物。通常，此类植物表现出基因型变异，导致不同品系之间的愈伤组织和芽形成率产生巨大的差异(Ivic-Haymes&Smigocki(2005)，“Identificationofhighlyregenerativeplantswithinsugarbeet(BetavulgarisL.)”，InVitroCellularandDevelopmentalBiology-Plant，41(4)，483-488；Mishutkina&Gaponenko(2006)，“Sugarbeet(BetavulgarisL.)morphogenesisinvitro:effectsofphytohormonetypeandconcentrationintheculturemedium,typeofexplants,andplantgenotypeonshootregenerationfrequency”，RussianJournalofGenetics)，42(2)，150-157；Tomita等(2013)，“Evaluationofthepotentialforsomaticembryogenesisinsugarbeet(BetavulgarisL.)breedinglinesandimprovementofregenerationefficiency”，PlantBiotechnology，30(5)，479-487)。通常，某些基因型的再生根本不可行。Kishchenko等，2005(“roductionoftransgeneticsugarbeet(BetavulgarisL.)plantsresistanttophosphinothricin”，Cellbiologyinternational，29(1)，15-19)以及Kagami等2015(“Sugarbeet(BetavulgarisL.)”，AgrobacteriumProtocols：Volume1，335-347)公开了用于甜菜转化公知方案，但是这些方案具有很强的基因型依赖性。在诱导单倍体胚胎发生以由例如小孢子产生双单倍体植物的情况下，已经发现，通过向培养基中添加如曲古菌素A(trichostatinA，TSA)的HDACi(组蛋白去乙酰化酶抑制剂)，可以使大大增加的源自多种植物物种的雄配子体的细胞经历胚胎发生生长(WO2015/044199A1)。然而，在愈伤组织形成和再生中使用TSA是相当不乐观的。在Furuta等((2011)，“TheCKH2/PKLchromatinremodelingfactornegativelyregulatescytokininresponsesinArabidopsiscalli”，Plantandcellphysiology，52(4)，618-628)中，拟南芥中突变体cytokininhypersensitive2(ckh2)的表征显示，组蛋白去乙酰化与细胞因子诱导的愈伤组织生长密切相关。在促进下胚轴外植体愈伤组织生长中，TSA的应用已被用作细胞分裂素的部分替代品。细胞分裂素(激动素)和TSA既不单独也不联合诱导愈伤组织生长。近来，Lee等((2016)，“Histonedeacetylation-mediatedcellulardedifferentiationinArabidopsis”，Journalofplantphysiology，191，95-100)描述了，组蛋白去乙酰化是拟南芥从叶片外植体形成愈伤组织所必需的。然而，用TSA进行处理导致愈伤组织形成具有缺陷。作为此的支持，一个亚组的HDAC基因在愈伤组织中上调，且某些hdac突变体表明愈伤组织形成能力降低。总结这些发现，似乎在拟南芥中TSA对由叶片诱导的愈伤组织具有相反的作用，并且与细胞分裂素组合，TSA并不在下胚轴外植体中诱导愈伤组织。令人意外地是，本专利技术人发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)，如TSA，对Betavulgaris物种植物(如糖用甜菜)中的愈伤组织诱导具有积极作用。TSA和其它HDACi的这种作用之前尚未针对间接再生方案证明，或证明可以克服例如甜菜基因型的困难。重要的是，TSA或任何其它HDACi均未用于任何作物转化方案中以提高效率。因此，本专利技术的第一方面是HDACi在用于由植物细胞，特别是由体细胞植物细胞或胚胎植物细胞，优选地是由分离自植物的外植体或其部分，诱导愈伤组织形成或产生具有增强的芽再生能力的愈伤组织的方法中的用途。胚胎植物细胞优选是非单倍体细胞。与在不使用HDACi的情况下产生愈伤组织和相同基因型的相同方法对比评估了芽再生的增强能力。专利技术简述本专利技术提供了一种用于由至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成或产生具有增强的芽再生能力的愈伤组织的方法，该方法包括在HDACi的存在下培养该至少一个植物细胞的步骤。原则上，仅使用一个植物细胞就足以实施本专利技术的方法。因此，如果在下文中使用多个“植物细胞”，则该措辞必须理解为需要最少数量的植物细胞。适用于本专利技术方法的植物细胞包括胚胎植物细胞和体细胞植物细胞。这些植物细胞的提供方式对于根据本专利技术的方法而言并不重要。例如，可以从分离自植物的外植体中提供胚胎或体细胞植物细胞。植物的哪一部分适合获得外植体取决于特定的植物物种。通常，合适的植物细胞可以从例如植物的下胚轴、叶柄、芽和轴向分生组织、叶片、花、薄壁组织或薄壁组织细胞、节间、种子、胚和根获得。根据本专利技术，“组蛋白去乙酰化酶抑制剂”本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成的方法，其包括在组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)的存在下培养所述至少一个植物细胞的步骤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171222 EP 17210361.61.一种由至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成的方法，其包括在组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)的存在下培养所述至少一个植物细胞的步骤。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个植物细胞是体细胞或胚胎细胞，优选地是从植物分离的外植体或其部分。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述HDACi是曲古菌素A(TSA)。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中培养所述至少一个细胞的所述步骤包括
(i)使所述至少一个细胞在包含所述HDACi的培养基中生长，优选所述HDACi浓度为0.01至5.0μM，和/或
(ii)将所述HDACi引入所述至少一个细胞中，例如通过轰击、电穿孔或显微注射将所述HDACi引入所述至少一个细胞中。


5.一种由愈伤组织再生芽的方法，其包括以下步骤：
(a)根据权利要求1至4中任一项所述的方法由至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成，以及
(b)在促进所述愈伤组织长出芽的条件下培养步骤(a)中获得的所述愈伤组织。


6.一种用于转化植物细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)根据权利要求1至4中任一项所述的方法由至少一个植物细胞诱导愈伤组织形成，以及
(b)将至少一个目的核苷酸序列引入到将在步骤(a)中使用的植物细胞中和/或引入到步骤(a)中获得的所述愈伤组织的细胞中。


7.一种用于产生转基因植物的方法，其包括以下步骤：
(a)根据权利要求6所述的方法转化植物细胞，以及
(b)由步骤(a)得到的转基因细胞或由其衍生的转基...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·帕切科维拉洛博斯，
申请(专利权)人：科沃施种子欧洲股份两合公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE