本发明专利技术涉及一种小麦籽粒多酚氧化酶活性的检测方法及其应用，属于小麦育种技术领域。本发明专利技术所述检测方法，包括以下步骤：1)将面粉与反应试剂混合，振荡30min，得到反应液；2)将步骤1)得到的反应液在0℃下静置5min，终止反应，得到终止反应液；3)将步骤2)得到的终止反应液进行离心，取上清加入酶标板，以反应试剂作为对照，利用酶标仪在475nm下测定吸光值，计算多酚氧化酶活性值。本发明专利技术所述检测方法准确、快速、简便，重复性好、稳定性高，能够实现变异范围广、遗传基础丰富的小麦籽粒PPO活性检测，筛选出环境间稳定存在的PPO活性较低的小麦新品种。
【技术实现步骤摘要】
一种小麦籽粒多酚氧化酶活性的检测方法及其应用
本专利技术涉及小麦育种
，具体涉及一种小麦籽粒多酚氧化酶活性的检测方法及其应用。
技术介绍
色泽是小麦面粉及面制品品质评价的重要指标。小麦籽粒多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)催化酚类物质发生氧化还原反应产生醌类物质或催化多酚类变为氧合醌，后者发生自身非酶促聚合或与蛋白质氨基酸残基或糖类发生反应，产生褐色或黑色的沉积物，是造成面粉及其制品酶促褐变的最主要原因，可以解释面粉及其制品加工储藏过程中50％～70％的颜色褐变。PPO不仅影响面制品表观色泽，还影响食品特性及营养品质，因而倍受面粉加工企业和育种家的关注。培育低籽粒PPO活性小麦品种，是对面制品色泽性状进行改良的重要途径，已成为小麦品质育种的重要目标。如何准确、快速、简便地测定小麦籽粒PPO活性，是育种家们急需解决的问题。利用分光光度法，分别以邻苯二酚和L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA，L-dihydroxyphenylalanine)为底物，是目前测定小麦籽粒PPO活性最为常见的两种方法。以邻苯二酚为底物进行小麦籽粒PPO活性的测定，能够大大提高PPO活性检测的精度和效率，操作简便，费用低。以L-DOPA为底物测定小麦籽粒PPO活性(美国谷物化学协会(AACC，AmericanAssociationforCerealChemistry)的标准方法(AACC22-85.01))，能够进一步提高小麦籽粒PPO活性检测精度。但目前测定PPO活性的检测通量很低，只能对样本逐个进行检测，操作繁琐，测定时间长，工作量大，检测效率低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种小麦籽粒多酚氧化酶活性的检测方法及其应用。本专利技术所述检测方法准确、快速、简便，重复性好、稳定性高，能够实现变异范围广、遗传基础丰富的小麦籽粒PPO活性检测，筛选出环境间稳定存在的PPO活性较低的小麦新品种。本专利技术提供了一种小麦籽粒多酚氧化酶活性的检测方法，包括以下步骤：1)将面粉与反应试剂混合，振荡30min，得到反应液；所述反应试剂为含L-3,4-二羟基苯丙氨酸的3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液；所述L-3,4-二羟基苯丙氨酸在所述3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液中的浓度为10mM；2)将步骤1)得到的反应液在0℃下静置5min，终止反应，得到终止反应液；3)将步骤2)得到的终止反应液进行离心，取上清加入酶标板，以反应试剂作为对照，利用酶标仪在475nm下测定吸光值，计算多酚氧化酶活性值；所述多酚氧化酶活性值的计算方法为：多酚氧化酶活性值＝(ΔA·g-1·min-1)×103，单位为U·g-1·min-1。优选的是，步骤1)所述面粉为小麦籽粒面粉。优选的是，步骤1)所述面粉的质量与反应试剂的体积比为0.2g：1.5mL。优选的是，步骤1)所述3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液中3-(N-吗啉)丙磺酸的浓度为50mM，所述3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液的pH值为6.5。优选的是，步骤1)所述振荡的条件为：200rpm，22℃下振荡。优选的是，所述振荡包括往复振荡。优选的是，步骤3)所述离心的条件为4℃，5000rpm离心10min。本专利技术还提供了上述技术方案所述检测方法在小麦育种中的应用。本专利技术还提供了上述技术方案所述检测方法在筛选籽粒多酚氧化酶活性低的小麦品种中的应用。本专利技术提供了一种小麦籽粒多酚氧化酶活性的检测方法。本专利技术方法以面粉为试验材料，反应时间缩短至30min，应用96孔酶标板和酶标仪同时可检测多个样本的PPO活性，检测效率提高约12～15倍。本专利技术所述检测方法准确、快速、简便，重复性好、稳定性高，能够实现变异范围广、遗传基础丰富的小麦籽粒PPO活性检测，筛选出环境间稳定存在的PPO活性较低的小麦新品种。附图说明图1为本专利技术提供的两种方法所测PPO活性的相关性结果图；图2为本专利技术检测方法测定PPO活性3次重复间的相关性结果图。具体实施方式本专利技术提供了一种小麦籽粒多酚氧化酶活性的检测方法，包括以下步骤：1)将面粉与反应试剂混合，振荡30min，得到反应液；所述反应试剂为含L-3,4-二羟基苯丙氨酸的3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液；所述L-3,4-二羟基苯丙氨酸在所述3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液中的浓度为10mM；2)将步骤1)得到的反应液在0℃下静置5min，终止反应，得到终止反应液；3)将步骤2)得到的终止反应液进行离心，取上清加入酶标板，以反应试剂作为对照，利用酶标仪在475nm下测定吸光值，计算多酚氧化酶活性值；所述多酚氧化酶活性值的计算方法为：多酚氧化酶活性值＝(ΔA·g-1·min-1)×103，单位为U·g-1·min-1。本专利技术将面粉与反应试剂(L-DOPA/MOPS溶液)混合，振荡30min，得到反应液；所述反应试剂为含L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA，L-3,4-dihydroxyphenylalanine)的3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS，(3-(N-Morpholino)propanesulfonicacid)缓冲液；所述L-3,4-二羟基苯丙氨酸在所述3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液中的浓度为10mM。在本专利技术中，所述面粉的质量与反应试剂的体积比优选为0.2g：1.5mL。在本专利技术中，所述面粉和反应试剂优选置于50mL离心管中进行反应，在本专利技术具体实施例中，本专利技术优选取0.2g面粉置于50mL离心管中，加入1.5mL反应试剂，迅速旋涡振荡混匀。在本专利技术中，所述面粉为小麦籽粒面粉。通过对小麦籽粒制备得到的面粉进行检测，可以测定小麦籽粒中多酚氧化酶的活性，进而实现小麦筛选。在本专利技术中，所述L-3,4-二羟基苯丙氨酸优选现配现用。在本专利技术中，所述3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液中3-(N-吗啉)丙磺酸的浓度为50mM，所述3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液的pH值为6.5。在本专利技术中，所述振荡包括往复振荡。在本专利技术中，所述振荡的条件优选为：200rpm，22℃下振荡，使样品充分暴露在空气中。本专利技术对所述往复振荡用仪器没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规往复振荡器即可。得到反应液后，本专利技术将反应液在0℃下静置5min，终止反应，得到终止反应液。得到反应液后，本专利技术优选迅速将反应液进行冷却，具体的，本专利技术优选将反应液转移至预先冷却好的2mL离心管中，并插入冰中静置。得到终止反应液后，本专利技术将终止反应液进行离心，取上清加入酶标板，以反应试剂作为对照，利用酶标仪在475nm下测定吸光值(A)，计算多酚氧化酶活性值；所述多酚氧化酶活性值的计算方法为：多酚氧化酶活性值＝(ΔA·g-1·min-1)×103，单位为U·g-1·min-1。在本专利技术中，所述离心的条件优选为4℃，5000rpm离心10min。本专利技术所述离心优选在冷冻离心机中进行。离心后，本专利技术优选吸取200μL上清液加入96孔酶标本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种小麦籽粒多酚氧化酶活性的检测方法，包括以下步骤：/n1)将面粉与反应试剂混合，振荡30min，得到反应液；所述反应试剂为含L-3,4-二羟基苯丙氨酸的3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液；所述L-3,4-二羟基苯丙氨酸在所述3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液中的浓度为10mM；/n2)将步骤1)得到的反应液在0℃下静置5min，终止反应，得到终止反应液；/n3)将步骤2)得到的终止反应液进行离心，取上清加入酶标板，以反应试剂作为对照，利用酶标仪在475nm下测定吸光值，计算多酚氧化酶活性值；所述多酚氧化酶活性值的计算方法为：/n多酚氧化酶活性值＝(ΔA·g
【技术特征摘要】
1.一种小麦籽粒多酚氧化酶活性的检测方法，包括以下步骤：
1)将面粉与反应试剂混合，振荡30min，得到反应液；所述反应试剂为含L-3,4-二羟基苯丙氨酸的3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液；所述L-3,4-二羟基苯丙氨酸在所述3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液中的浓度为10mM；
2)将步骤1)得到的反应液在0℃下静置5min，终止反应，得到终止反应液；
3)将步骤2)得到的终止反应液进行离心，取上清加入酶标板，以反应试剂作为对照，利用酶标仪在475nm下测定吸光值，计算多酚氧化酶活性值；所述多酚氧化酶活性值的计算方法为：
多酚氧化酶活性值＝(ΔA·g-1·min-1)×103，单位为U·g-1·min-1。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)所述面粉为小麦籽粒面粉。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：翟胜男，刘建军，李豪圣，宋健民，刘爱峰，曹新有，程敦公，刘成，郭军，李法计，韩冉，訾妍，汪晓璐，赵振东，何中虎，夏先春，
申请(专利权)人：山东省农业科学院作物研究所，中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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