6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备苯妥英检测试剂中的用途制造技术

本申请涉及6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备苯妥英检测试剂中的用途。具体而言，本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型6‑磷酸葡萄糖脱氢酶包含选自以下的一个突变：D306C、D375C、G426C。使用本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体所制备的检测试剂盒，其特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量检测。

【技术实现步骤摘要】
6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备苯妥英检测试剂中的用途本申请要求中国专利申请号201910017764.4(优先权日2019年1月9日)和中国专利申请号201910423122.4(优先权日2019年5月21日)《6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途》的优先权，其通过引用并入此处。
本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种多位点突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在苯妥英检测试剂盒中的应用。
技术介绍
半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。苯妥英(Phenytoin，PTN)，作为半抗原的具体实例，苯妥英是一种抗癫痫的外源性小分子药物。正常人的血清与血浆中不存在此物质，临床一般使用其钠盐形式。苯妥英钠作为传统抗癫痫药物，药理作用机制主要是阻滞电压依赖性Na+通道，减少Na+内流稳定神经元细胞膜，降低其兴奋性，从而阻止局部异常放电向正常脑组织扩散。苯妥英钠口服后1.5至30小时达峰浓度，一般连续给药6至10天可达有效血药浓度，其价格低廉、疗效确切，目前在临床广泛使用。但是，因其药代动力学特殊，治疗窗口狭窄，易导致药物过量而中毒，且中毒后临床表现多样，易误诊。所以，在临床诊断的过程中，需要不断的监测苯妥英在血中的药物浓度。通常血药浓度在10-20μg/ml时能够达到最佳的治疗效果，且不会对人体产生毒害作用。而血药物浓度高于20μg/ml时，能够对人体的肝脏及肾脏产生毒性，轻则昏迷，重则死亡。一般在停止用药2-4周，经人体肝脏及肾脏代谢后，能够将苯妥英的血药浓度降低至0.5μg/ml或者更低的水平。目前已知的苯妥英检测方法主要有：酶联免疫吸附法、均相酶免疫测定法、化学发光免疫分析法、高效液相色谱法、荧光偏振法等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如放射免疫分析法同位素具有放射性污染、有效期较短、操作不方便等诸多弊端，酶联免疫吸附法操作较为繁琐、耗时较长，不适宜在临床上使用。化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(EMIT)检测为主。均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原(如G6PDH-苯妥英)与非标记抗原(苯妥英)，竞争与定量的抗体(苯妥英抗体)进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物NAD+生成NADH就越多，在340nm波长下检测NADH的吸光度变化，即可推算出液体中苯妥英的含量。
技术实现思路
鉴于本领域的需求，本申请提供了一种新型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备苯妥英检测试剂盒中的用途。根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。区别于已有发表的专利US006090567A(Homogeneousimmunoassaysusingmutantglucose-6-phosphatedehydrogenases)的6磷酸葡萄糖脱氢酶的突变体，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变：D306C、G426C、D375C。根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4。根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸。根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：n偶联而成。在一些实施方案中，n是1至50，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50。在一些具体的实施方案中，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比优选为1：1。在一些具体的实施方案中，半抗原的分子量为100Da至4000Da，例如：100、150、200、250、300、350、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、550、570、600、620、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000。根据本申请，技术人员将理解，“半抗原”还包含其衍生物的形式。为了便于和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进行偶联，对于那些自身不带有偶联基团(例如，与巯基反应的基团)的半抗原(例如苯妥英)，可以经改造而带有接头，以便和巯基共价结合。因此，在本申请中，半抗原衍生物是指，经改造而带有巯基反应基团的半抗原。半抗原选自：小分子药物(如抗生素、精神药物)、激素、代谢物、糖、脂质、氨基酸。半抗原例如但不限于：苯妥英、维生素D、25羟维生素D、1，25双羟维生素D、叶酸、强心甙、酶酚酸、雷帕明、环胞菌素A、乙胺碘复酮、甲胺喋呤、他克莫司、血清氨基酸、胆汁酸、甘胆酸、苯丙氨酸、乙醇、尿尼柯丁代谢产物柯替宁、尿吗啡、尿单羟酚衍生物、神经肽酪氨酸、血浆甘丙素、多胺、组织胺、促甲状腺激素、泌乳素、胎盘泌乳素、生长激素、促卵泡刺激素、促黄体生成素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种偶联物，其是6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：1偶联而成；/n所述半抗原是苯妥英或其衍生物；/n优选，所述苯妥英衍生物是下式所示：/n

【技术特征摘要】
20190109 CN 2019100177644;20190521 CN 2019104231221.一种偶联物，其是6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：1偶联而成；
所述半抗原是苯妥英或其衍生物；
优选，所述苯妥英衍生物是下式所示：





2.根据权利要求1所述的偶联物，其中：
所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，相较于野生型6-磷酸葡萄糖脱氢酶，包含选自以下的一个突变：D306C、D375C、G426C；
优选地，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4。


3.一种试剂，其包含权利要求1所述的偶联物。


4.权利要求1所述的偶联物在制备检测试剂中的用途：
所述检测试剂是苯妥英的检测试剂；
优选地，所述检测试剂选自：酶联免疫法检测试剂、化学发光免疫法检测试剂、均相酶免疫法检测试剂、胶乳增强免疫比浊法检测试剂。


5.一种苯妥英检测试剂盒，其包含：
第一试剂，所述第一试剂包含底物、苯妥英抗体；
第二试剂，所述第二试剂包含权利要求1所述的偶联物；
任选地，校准品，所述校准品包含10mM至500mM缓冲液、0mg/L至42mg/L苯妥英；以及
任选地，质控品，所述质控品包含10mM至500mM缓冲液、0mg/L至42mg/L苯妥英。


6.根据权利要求5所述的苯妥英检测试剂盒，其包含：
第一试剂，其包含：
10mM至500mM，优选100mM至300mM缓冲液、
5mM至25mM，优选10mM至20mM底物、
0.1mg/L至5mg/L，优选1mg/L至2.5mg/L的苯妥英抗体、
10mM至300mM，优选150mM至200mMNaCl、
0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L稳定剂、
0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L表面活性剂、
0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L防腐剂；
第二试剂，其包含：
10mM至500mM，优选100mM至300mM缓冲液、
0.1mg/L至1mg/L权利要求1中所述的偶联物、
0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L稳定剂、
0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L表面活性剂、
0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L防腐剂；
所述缓冲液选自以下的一种或组合：氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基甲烷缓冲液；优选磷酸盐缓冲液；
所述缓冲液的pH为6至8，优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚俊，祁金祥，张启飞，肖兰萍，王贵利，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11