用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒及文库构建方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒。其包括对应于待测样本中核苷酸序列的多对引物探针组、核酸外切酶、核酸连接酶和核酸聚合酶，还包括其他的建库试剂。本发明专利技术还涉及一种用于检测地中海贫血基因突变的文库构建方法。其包括步骤一、提供一反应体系；步骤二、杂交；步骤三、酶切纯化；步骤四、延伸连接纯化；步骤五、富集。本发明专利技术提供的试剂盒及文库构建方法具有全基因组文库构建、操作简单、实验步骤短、成本低、准确性高、富集效率高达80％以上等优点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒及文库构建方法
本专利技术涉及基因测序
，具体涉及一种用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒及文库构建方法。
技术介绍
地中海贫血(Thalassemia)(简称地贫)是由于珠蛋白基因发生缺陷，导致珠蛋白链的合成减少或缺如，使形成血红蛋白的α-链/非α-链比例失衡，而导致的一组单基因遗传性、溶血性疾病。轻者可无临床表现，重者以进行性贫血为主要特征。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，地贫可以分为α-地贫、β-地贫、δ-地贫、γ-地贫、δβ-地贫和εγδβ-地贫。临床上，地中海贫血又分为轻型(地中海贫血基因携带者)、中间型和重型3个类型。α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因(HBA2和HBA1)缺失或非缺失突变，导致α珠蛋白链功能异常，或合成减少而引起的一种遗传性溶血性疾病。引发α-地中海贫血的突变主要是类α-珠蛋白基因簇的大片段缺失，此外，还有少量α-地中海贫血是由于α2或α1基因的点突变导致。β-地中海贫血的分子基础是珠蛋白基因(HBB)的点突变或核苷酸序列缺失，造成β珠蛋白合成的减少或缺如。β-珠蛋白基因突变主要分为两大类：一类是非缺失型突变，包括转录突变、RN加工突变、翻译突变、显性遗传性β地中海贫血和高度不稳定性血红蛋白、转录起始点突变、起始密码子突变、非翻译区突变、PolyA加合信号的突变。另一类是缺失型突变。另外，类β-珠蛋白基因簇的大片段缺失会导致β-地中海贫血或遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(Hereditarypersistenceoffetalhemoglobin，HPFH)。目前世界上已发现至少300种α-珠蛋白基因变异和200余种β-珠蛋白基因变异，而在中国人群中目前报道的至少有57种(包括19种缺失型和38种非缺失型)α-地中海贫血和95种β-地中海贫血突变类型。而携带有其中6种α-地中海贫血突变(--SEA/、-α3.7/、-α4.2/、αWSα/、αCSα/、αQSα/)和8种β-地中海贫血突变[CD41-42(-CTTT)、IVS-II-654(C＞T)、CD71-72(+A)、CD17(AAG＞TAG)、-28(A＞G)、CD26(GAG＞AAG)、-29(A＞G)和CD43(GAG＞TAG)]的人群数量分别占了α-地中海贫血突变和β-地中海贫血突变人群总数的98％和95％以上。个别重要的遗传修饰基因(KLF1、BCL11A、HMIP等)突变也能导致β-地贫样表型。地贫集中在热带和亚热带地区，多发生于地中海沿岸国家，其次为中东、印度、巴基斯坦、东南亚、中国南方和北非，美国是移民国家，其发生率也较高。我国长江以南各省是地贫高发区，广东、广西、海南、台湾和香港等地受累人口超过2亿。目前地贫尚无根治的方法，只能依靠传统方法治疗，即以输血治疗为主，价格昂贵，因此产前筛查和诊断对预防该种出生缺陷疾病具有重大意义。目前，诊断地贫基因变异的技术有跨越断裂位点PCR(Gap-PCR)、实时荧光PCR、多重连接探针扩增法(Multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA)和反向点杂交(Reversedotblot，RDB)技术。多种高灵敏度的技术方法也被尝试用于地贫检测，如质谱、数字PCR、COLD-PCR等。但这些基于单一位点的PCR技术的检测方法存在一定的局限性。DNA测序是最直接最准确的判断突变的位置和性质的方法，尽管费用相对较高，仍然是检测未知的地贫突变基因的关键方法。基于高通量测序技术的DNA全基因组测序或者目标区域捕获测序可以更加准确的实现对地贫基因的检测，但全基因组测序的成本以及分析方法的复杂性限制了在临床上的应用，而针对目标基因区域进行富集后的二代测序是比较经济适用的方法，适合临床应用推广。目前市场常用的目标区域富集方法主要是基于PCR扩增、环化和杂交捕获的目标区域富集。PCR扩增包含常规的标准多重PCR以及商业化高通量多重PCR(如，IonAmpliSeqTMfromLifeTechnologies，GeneReadDNAseqSystemfromQiagen，TargetRichTMfromKailos)，微液滴PCR(如，RainDance)，或者基于芯片的PCR(如，AccessArrayTMfromFluidigm)。“环化”也叫分子倒置探针(Molecularinversionprobes，MIPs)，间隙填充挂锁探针(Gap-fillpadlockprobes)或选择器探针(Selectorprobes)。在100-500kb的范围区间，通过一种高特异性的方式(间隙填充和连接反应)形成包含目标区域序列的单链DNA环，进而产生包含共同DNA原件的结构，用于对感兴趣的靶区域进行选择性扩增，比较代表性的方法有Haloplex(Agilent)和MIPs。杂交捕获指样品中的核酸和锚定在固相支持物或者直接存于液体中的与目标区域互补的DNA/RNA探针杂交，然后通过物理捕获的方式分离出感兴趣的序列。捕获范围从500kb到整个全外显子组，发展出了一些经典的商业化杂交方法，比如SureSelect(Agilent)，Nextera(Illumina)，TruSeq(Illumina)，SeqCap(Nimble-Gen)，IonTargetSeq(LifeTechnologies)，这些方法对大范围和预设计的区域有更好的捕获效率和成本效率。国内天昊基因科技有限公司于2012年专利技术了一种基于杂交延伸连接的多重目标基因片段富集技术(参考“一种高通量核酸分析方法及其应用”，专利号：ZL201210581830.9)，该技术针对目标区域片段设计1个上游延伸引物以及1个下游阻滞探针，变性复性后与同一条DNA链结合，在同一个反应体系中，在热稳定DNA聚合酶以及热稳定DNA连接酶作用下产生1条延伸连接产物；通常延伸引物5端以及阻滞探针3端加上与高通量测序平台兼容的通用序列，这样延伸连接产物可以在纯化之后利用通用PCR引物进行扩增完成高通量测序文库的构建；该技术方法具备操作简单、体系易于优化，而且通过该方法富集之后的文库测序数据可以用于目标基因片段拷贝数的精确检测。该公司于2020年在此技术基础上进行了进一步优化，将杂交与延伸连接分开，样本经变性杂交后利用ExoI外切酶对未杂交的延伸引物进行切除，然后再进行硅胶膜柱或磁珠纯化，纯化产物再进行同一体系延伸连接扩增富集(参考“一种靶基因区域快速富集方法”，专利号：202010647922.7)。该方案通过技术优化，显著降低非特异扩增背景，进一步降低体系优化难度，显著提高文库测序质量。本专利技术提供一种基于上述专利技术(专利号：202010647922.7)的“杂交纯化-延伸连接”富集技术方案(参见图1)，应用于Illumina二代测序平台的地中海贫血基因突变检测文库构建方法及试剂盒。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供地中海贫血基因突变检测文库构建方法及试剂盒，其核心点本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括对应于待测样本中核苷酸序列的多对引物探针组、核酸外切酶、核酸连接酶和核酸聚合酶；还包括其他的建库试剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括对应于待测样本中核苷酸序列的多对引物探针组、核酸外切酶、核酸连接酶和核酸聚合酶；还包括其他的建库试剂。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每一对引物探针组分别包含5’延伸引物和3’阻滞探针；其中，
所述5’延伸引物不能被5'端方向核酸外切酶降解，所述5’延伸引物包括与目标核酸片段3'端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列相对应的第二部分；
所述3’阻滞探针不能被3'端方向核酸外切酶降解，所述3’阻滞探针包括与目标核酸片段5’端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列特异性杂交的第二部分；
所述多对引物探针组的序列信息如SEQIDNO：1-98所示。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸外切酶的修饰为硫代修饰，即所述3’阻滞探针的5'端磷酸化修饰，3'端硫代修饰；所述核酸聚合酶为高温耐热核酸聚合酶；所述核酸连接酶为高温耐热核酸连接酶。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述其他的建库试剂包括：
(1)DNA变性液：含有变性剂的缓冲液；
(2)引物探针混合液：用于多对引物探针组溶解在杂交缓冲液；
(3)核酸外切酶缓冲液；
(4)延伸连接缓冲液：为核酸聚合酶和核酸连接酶的PCR反应及连接反应提供反应组分及缓冲环境；
(5)延伸连接酶混合液：用于核酸聚合酶及核酸连接酶配比混合；
(6)PCR缓冲液：为核酸聚合酶提供反应组分及缓冲环境；
(7)TaqDNA聚合酶；
(8)磁珠悬浮液；
(9)磁珠洗脱液A及磁珠洗脱液B。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA变性液组分为：0.6875×TE，pH8.0，1.25×GCsolution；
所述引物探针混合液组分为：0.003μM/延伸引物，0.006μM/阻滞探针，30mMTris-Cl，150mMNaCl，0.3mMEDTA，pH8.0，5ng/μL鱼精；
所述核酸外切酶缓冲液组分为：4.5×ExoIBuffer，20mMMgCl2；
所述延伸连接缓冲液组分为：0.76×GCsolution，3.05×HemoKlenTaqBuffer，NAD3.05mM，MgCl27.63mM，dNTP0.61mM；
所述延伸连接酶混合液组分为：0.4μlHemoKlenTaq+0.1μlTaqDNAligase；
所述PCR缓冲液组分为：1.65×GCbuffer1，0.49dNTP，0.82mMMgCl2；
所述磁珠纯化洗脱液A组分为：30mMKCl10mMTris-Cl，pH8.0；
所述磁珠纯化洗脱液B组分为：10mMTris-Cl，pH8.0。


6.一种用于检测地中海贫血基因突变的文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、利用权利要求1-7中任一项所述的试剂盒，提供一反应体系；
步骤二...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐湘民，滕祥云，李琦，黄少亚，周姗，阳治国，陆世鑫，
申请(专利权)人：广州赛乐斯密医学科技有限公司，南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44