一种急性髓性白血病的新型诊断方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一组急性髓性白血病特异的DNA甲基化元件CYP26C1‑DMR、DGKG‑DMR、WT1‑DMR、TRIM40‑DMR，以及一种通过检测这些元件的甲基化水平来辅助诊断急性髓性白血病的方法。这组DNA甲基化元件在急性髓性白血病中异常高甲基化，可作为一种急性髓性白血病的特异性肿瘤标志物,具有重要的临床价值。

【技术实现步骤摘要】
一种急性髓性白血病的新型诊断方法及其应用
本专利技术涉及肿瘤诊断领域，具体涉及一种表观遗传标志物在急性髓性白血病诊断中的应用。
技术介绍
白血病发病率在我国呈现逐年上升的趋势，而急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)是急性白血病中最常见的类型。辐射照射、化学物质接触甚至一些化疗手术都可能会引发AML。来源于骨髓和外周血的AML细胞会过度增殖从而阻碍正常血细胞的产生，会使得患者免疫系统受损，患传染病的风险提高，同时又常伴有呼吸短促、乏力、发烧等一系列症状。AML的病程发展非常迅速，如果没有得到及时治疗，患者在几个月甚至几周内就可能死亡。AML患者主要来自老年群体，对于60岁以上的患者群体，AML的治愈率极低(约为10％)。目前化疗是用于治疗AML的主要手段，造血干细胞移植也会作为辅助治疗手段，但是老年患者的身体情况往往不能承受密集的化疗，使得治疗效果常常受制。此外AML的早期患者所表现出的症状与一些常见疾病极为相似，这无疑增加了患者未能被确诊AML从而错过治疗的最佳时机的可能性。AML的早期诊断主要依赖于骨髓涂片计算原始细胞比例，通过细胞形态和化学染色进行分型。近年来随着荧光原位杂交(FISH)、高通量测序、流式细胞术等技术的成熟，染色体突变、基因突变、细胞表面抗原检测等纷纷被用于AML诊断及预后评估。虽然这些技术都有助于AML的诊断及预后，但考虑到AML的亚型和分类之多，诊断和预后的准确性仍然存在这很大的提升空间。因此，寻找合适的诊断标记物来提高诊断水平是当前治疗AML的一个重要任务。而除了患者的基因型、染色体核型等基本标志物以外，近年来对于表观遗传学的深入研究使得患者的表观遗传特征也可被用于进行AML诊断和预后。尽管目前多数表观遗传学研究仍处于理论阶段，其临床应用前景仍然十分广阔。作为最早被发现且研究最为清楚的表观调控因子，DNA甲基化在细胞分化、印记基因、X染色体失活、转座元件抑制等方面扮演着重要角色。DNA甲基化作为一种极富前景的肿瘤诊断标志物被越来越多地报导，但较少应用到临床。DNA甲基化作为肿瘤诊断标志物的优势有二。其一，其他种类的肿瘤诊断分子标志，如点突变，同一基因在不同肿瘤甚至同类肿瘤不同个体中突变的位点完全不同，现有技术难以全面覆盖；而DNA异常甲基化广泛地存在于几乎所有种类的肿瘤，且同类肿瘤其异常区域相同，检测方便精确。其二，DNA甲基化作为诊断标志物的特异性较好，虽然不同类肿瘤都可能存在相同基因的异常甲基化，但因为异常情况发生的频率不同，存在明显的肿瘤类型相关性，所以每种肿瘤都有一个独特的基因甲基化图谱。综上，DNA甲基化作为肿瘤诊断标志物具有广阔的临床应用前景。有研究表明DNA甲基转移酶-DNMT3A突变可使正常的造血干细胞转变为AML前体状态。这提示DNA甲基化异常是AML的早期事件，通过检测特定甲基化区域有可能实现对AML的早期筛查。近年来随着DNA甲基化测序和二代测序技术的兴起，研究者们已经揭示了AML病人全基因组DNA甲基化图谱，这些研究为AML早期诊断提供了重要铺垫。专利技术人通过大数据分析鉴定出CYP26C1-DMR、DGKG-DMR、WT1-DMR、TRIM40-DMR等4个分别位于CYP26C1、DGKG、WT1、TRIM40等基因本体或者临近位置的AML特异性DNA甲基化元件。这四个元件的DNA甲基化水平在AML显著升高，提示它们具有用来辅助诊断AML的潜力。
技术实现思路
本专利技术收集了TCGA(TheCancerGenomeAtlas)和GEO(GeneExpressionOmnibus)数据库中AML和正常人骨髓及外周血的DNA甲基化芯片数据(GEO编号：GSE58477、GSE86409、GSE105420、GSE51388)，通过差异甲基化分析鉴定出4个在AML中异常高甲基化的DNA元件：CYP26C1-DMR、DGKG-DMR、WT1-DMR、TRIM40-DMR，提示可以利用这四个甲基化元件来辅助诊断AML。另外，通过收集GEO数据库中AML和正常人骨髓及外周血的RRBS(Reducedrepresentationbisulfitesequencing)数据(GEO编号：GSE37454、GSE52945、GSE77026、GSE98350)进行验证，同样显示这4个DNA甲基化元件在AML中异常高甲基化，提示不同的DNA甲基化检测方法都可以利用这4个DNA甲基化元件的甲基化水平对AML进行诊断。表1DNA甲基化元件的坐标(基因组：hg19)为了开发便于检测的方法，专利技术人进一步缩减了这4个DNA甲基化元件的长度至～200个碱基。本专利技术提供了一种利用靶向目标区域甲基化测序的方法来检测这四个元件的DNA甲基化水平。简单来说，需要抽取外周血样本，提取基因组DNA，经重亚硫酸盐转化后使用针对这四个元件设计的特异性引物(表2)进行多重PCR扩增，然后用含测序接头的引物再进行扩增构建文库，文库检测合格后，使用二代测序仪进行测序，然后通过生物信息分析，确定目标区域各个CpG位点的甲基化水平，对这些甲基化位点取平均值得到各个元件的总体甲基化水平。专利技术人对自己收集到的正常人和AML病人样本用上述方法进行了检测，结果同样显示AML病人中这4个元件的DNA甲基化水平要明显高于正常人。所述方法可以概括为，抽提外周血DNA，提取基因组DNA，将DNA模板中未甲基化的C转化为T，采用多重PCR反应对4个DNA甲基化元件的片段同时扩增，向PCR样本添加测序标签序列，对产物测序，并进行数据分析，确定各个CpG位点的甲基化率。表2引物序列信息靶向目标区域甲基化测序结果同样显示AML中CYP26C1-DMR、DGKG-DMR、WT1-DMR、TRIM40-DMR等元件的DNA甲基化水平要明显高于正常人，而且该方法检测得到的甲基化模式和DNA甲基化芯片数据非常相似，提示本专利技术建立的方法是准确可靠的。而且结果也再一次验证了这4个元件的甲基化水平是在AML中特异性升高的。为了临床方便利用这4个DNA甲基化元件的DNA甲基化水平对AML进行诊断，本专利技术构建了用于预测AML的计算模型。专利技术人将DNA甲基化芯片数据分为实验组和验证组，用实验组的数据来构建了logistic回归模型。使用该回归模型对验证组中的AML进行诊断，结果显示该模型具有优秀的敏感性和特异性。为了进一步验证模型，专利技术人又利用靶向目标区域甲基化测序得到的结果通过logistic回归模型进行预测。结果显示，该回归模型可以准确判断AML病人和正常人。总的来说，本专利技术提供了4个可以用于诊断AML的DNA甲基化元件：CYP26C1-DMR、DGKG-DMR、WT1-DMR、TRIM40-DMR(在基因组中的坐标见表1)。本专利技术建立了一个完整的检测这些元件甲基化水平的方法，包括方法中涉及到的试剂盒、针对甲基化元件设计的引物、反应条件及分析流程等。本专利技术提供了一个可以用来诊断AML的logistic回归模型，该模型可以利用CY本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.DNA甲基化元件CYP26C1-DMR、DGKG-DMR、WT1-DMR或TRIM40-DMR作为急性髓性白血病肿瘤标志物的用途，其特征在于所述DNA甲基化元件的甲基化水平在急性髓性白血病细胞中显著增高。/n

【技术特征摘要】
1.DNA甲基化元件CYP26C1-DMR、DGKG-DMR、WT1-DMR或TRIM40-DMR作为急性髓性白血病肿瘤标志物的用途，其特征在于所述DNA甲基化元件的甲基化水平在急性髓性白血病细胞中显著增高。


2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的用途为制备特异性检测CYP26C1-DMR、DGKG-DMR、WT1-DMR和/或TRIM40-DMR的DNA甲基化水平的试剂盒。


3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述试剂盒包含SEQIDNO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱鹏旭，姜蓬垒，韩颖丽，
申请(专利权)人：锐甲生物技术徐州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32