生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及其在催化合成OPO中的应用技术

本发明专利技术涉及一种生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及在催化合成OPO中的应用，在磷酸盐缓冲液中，加入脂肪酶和一定比例的氯化钙溶液，随后将混合物静置于1～8℃，得到固定化脂肪酶，并将其应用于催化合成1,3‑二油基‑2‑棕榈酰甘油酯。本发明专利技术工艺简单，制备得到的固定化脂肪酶的温度稳定性得到明显提高，用于催化合成1,3‑二油基‑2‑棕榈酰甘油酯时，催化产率高；本发明专利技术可以有效改善脂肪酶的热稳定性和催化活性。

【技术实现步骤摘要】
生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及其在催化合成OPO中的应用
本专利技术涉及一种酶的固定化方法，尤其是涉及一种生物矿化型固定脂肪酶的制备及其在催化合成OPO中的应用。
技术介绍
酶是催化生物和化学反应的一种蛋白质，其广泛的存在于植物、动物和微生物中。具有催化活性高、选择性强、专一性好、成本低、反应条件温和以及可被生物降解等优点。因此酶在精细化学、药物化学、食品或能源等各个领域都有很高的应用。生物催化过程作为一种合理、高效的转化方法受到了广泛的关注。酶促工艺在支持可持续绿色化工中的发挥了重要作用。然而，天然酶在实际应用中普遍操作和储存稳定性较差、酶的回收和重复利用困难、成本高，而且还会受到反应液的影响。因此，固定化在酶催化中是常用的改善的方法。在实际应用中，固定化酶在稳定性、生物催化剂负载、可回收性等方面具有优势。固定化是成功实现以酶为基础的工业过程的关键技术，特别是用于生产绿色和可持续能源或生物衍生的催化转化化学品(工业化)。酶的固定化可以改变酶的活性、特异性或选择性，这为增加酶在底物上的可用性提供了一个良好的基础。如今，仿生矿化已被开发为制备仿生材料的便捷方法。具有纳米尺度特征的有机-无机杂化纳米材料是一类由金属离子和有机组分(蛋白质、多肽、氨基酸到DNA/RNA等生物分子)自组装而成的花状纳米材料。2012年，Zare等人首次发现并报道了一种使用硫酸铜(II)作为无机成分以及包含蛋白质来创建蛋白质-无机杂化纳米花的方法，该成分增强了活性和稳定性。随着技术的不断发展，目前用于制备杂化无机纳米花的无机金属离子也已从Cu2+扩展到Co2+，Ca2+，Mn2+等，可应用于在生物医学领域，包括生物传感、生物催化和癌症治疗等方面。重金属的危害已对人类健康和环境造成潜在危害，引起了全世界的广泛关注,绿色理念是发展化学的根本。自然界中一半以上的生物矿物质是含钙的矿物质，包括骨骼因此，Ca2+用来固定酶是更具有生物相容性的。Amjad及其合作者研究了蛋白酶-无机杂化纳米复合材料(alcalase@CaHPO4)用于大豆分离蛋白水解，提高酶的稳定性和催化能力，并且催化能力是游离酶的1.5倍。Zhang等人研究了一种新型固定化脂肪酶ZC12/Ca3(PO4)2杂化纳米花，该纳米花使kcat/Km值是游离的206％和2.31倍酶活性，并且在较低的温度下比活性更高。Tian等人制备了CaHPO4-PGUS1杂化纳米复合材料，在最佳条件下，1.2mg的CaHPO4-PGUS1混合纳米沉淀的固定化效率为71.2％，并具有118％的相对活性。通过上述方法合成的纳米复合材料具有良好的活性和稳定性，又由于Ca2+具有很大的生物相容性，在食品工业和生物技术中有很大的应用前景。生物矿化的主要过程是在有机体的精确控制下，选择性地将无机元素沉积在特定的有机大分子上，并将溶液中的离子转化为固相矿物。其广泛存在于如骨骼，牙齿和贝壳等生物组织中。在此过程中，酶可以作为生物大分子参与体内磷酸钙形成，并通过降低矿物质的溶解度，对矿化过程产生巨大影响。采用共沉淀法制备了蛋白质-无机杂化纳米复合材料，通常包括四个过程:配位、共沉淀、自组装和尺寸生长。蛋白质(多肽或氨基酸)的胺基团与金属离子(II)(Cu2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+)通过配位反应相互作用，成为形成金属(II)磷酸盐初级纳米颗粒的成核位点。与此同时，蛋白质作为一种封盖剂，帮助这些颗粒保持纳米花的板状形态。在合成过程中优化合成条件，包括合成时间、温度、pH值和各组分等的浓度，以获得理想的纳米尺寸。生物矿化在固定化中的应用，不仅对固定化的酶的酶活没有影响，酶活还有所提高，说明该方法更加具有生物相容性，且绿色环保，固定方法简便可行性较高。纳米复合材料具有良好的活性和稳定性，同时Ca2+具有很大的生物相容性，在食品工业和生物医药行业中有很大的应用前景。
技术实现思路
为了提高游离酶的利用效率以及节约成本，本专利技术提供了一种生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及其在催化合成OPO(1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯)中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种生物矿化型固定脂肪酶的制备方法，在磷酸盐缓冲液中，加入脂肪酶和一定比例的氯化钙溶液，随后将混合物静置于1～8℃，得到固定化脂肪酶。作为优选，所述脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)。作为优选，脂肪酶通过下述方法得到：首先，在pPIC9K载体上构建疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因，然后将重组质粒转移至毕赤酵母菌株GS115中，诱导表达后获得脂肪酶。作为优选，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol·L-1，pH为7.0。作为优选，加入的脂肪酶的终浓度为0.05～0.25mg·mL-1。作为优选，加入的氯化钙溶液的浓度为0.2mol·L-1，磷酸盐缓冲液体积与氯化钙溶液体积比为40～60：1。作为优选，所述生物矿化型固定脂肪酶的制备方法，具体包括下述步骤：在100mL磷酸盐缓冲液中，加入终浓度为0.1mg·mL-1的脂肪酶和2mL氯化钙溶液，随后将混合溶液放置在4℃下放置24小时，10000rpm离心10min，得到固定化脂肪酶，即为TLL@羟基磷灰石纳米花(TLL@HAp-NFs)。并用磷酸盐缓冲液洗涤后，用于后续检测和催化。本专利技术还提供了上述生物矿化型固定脂肪酶在催化合成OPO中的应用。将脂肪酶TLL利用生物矿化的方式固定，将脂肪酶分散在在磷酸盐缓冲液中，加入一定比例的CaCl2溶液，有明显白色沉淀生成，随后将混合物静置，得到固定化酶，并应用于催化合成1,3-二油基-2-棕榈酰甘油酯(OPO)。其反应化学式为：作为优选，所述生物矿化型固定脂肪酶在催化合成OPO中的应用，包括下述步骤：加入底物三棕榈酸甘油酯、油酸、固定化脂肪酶、正己烷，在摇床中反应得到OPO(1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯)。作为优选，所述三棕榈酸甘油酯、油酸的摩尔比为1：2～10，反应中含水量为2％；摇床反应条件为：温度25～55℃，转速220rpm。将固定化酶用于催化合成1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯中，改变催化反应中的含水量、溶剂、反应温度、反应时间、底物比例、加入的酶量，提高产物的含量。本专利技术利用与生物更相容的羟基磷灰石对重组蛋白在温和的条件下进行固定化，用于对催化反应条件及产率的改善和提高。利用真菌毕赤酵母表达重组蛋白TLL，基于生物矿化方法，将TLL固定化，用于OPO的催化合成，改善脂肪酶催化位置的选择性，进而提高目标产物OPO在反应中的含量。固定化酶在40℃，50℃水浴5小时后，残留的相对酶活性均可以保持在90％以上，游离酶的酶活剩余为40％左右。在70℃时，前1h内游离酶活性迅速下降至23％左右，TLL@HAp-NFs仅损失了约30％的酶活。在最佳催化条件下，反应液中OPO含量可达50.6％。因此该固定方法的选用，可以改善了脂肪酶的热稳定性和催化活性。附图说明图1是本专利技术的制备流程图；图2是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物矿化型固定脂肪酶的制备方法，其特征在于：在磷酸盐缓冲液中，加入脂肪酶和一定比例的氯化钙溶液，随后将混合物静置于1～8℃，得到固定化脂肪酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种生物矿化型固定脂肪酶的制备方法，其特征在于：在磷酸盐缓冲液中，加入脂肪酶和一定比例的氯化钙溶液，随后将混合物静置于1～8℃，得到固定化脂肪酶。


2.根据权利要求1所述的生物矿化型固定脂肪酶的制备方法，其特征在于：所述脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。


3.根据权利要求2所述生物矿化型固定脂肪酶的制备方法，其特征在于脂肪酶通过下述方法得到：首先，在pPIC9K载体上构建疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因，然后将重组质粒转移至毕赤酵母菌株GS115中，诱导表达后获得脂肪酶。


4.根据权利要求1或3所述生物矿化型固定脂肪酶的制备方法，其特征在于：磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol·L-1，pH为7.0。


5.根据权利要求1所述生物矿化型固定脂肪酶的制备方法，其特征在于：加入的脂肪酶的终浓度为0.05～0.25mg·mL-1。


6.根据权利要求1所述生物矿化型固定脂肪酶的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢恬，王安明，李宁宁，张静，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33