一种中性蛋白酶的制备方法技术

本发明专利技术属于发酵技术领域，提出了一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：A、将枯草芽孢杆菌种子液接种至发酵培养基中发酵培养，培养温度为25～28℃，培养时间为14～16h，得到初发酵液；B、向初发酵液中加入补料培养基培养12～15h，得到发酵液；C、将发酵液经絮凝、精滤、超滤浓缩、稳定处理后得到中性蛋白酶成品；发酵培养基的pH值为6.5‑6.8，其包括以下重量份的组分：红薯淀粉30～50份，豆饼粉20～30份，南瓜粉5～10粉，腐殖酸镁1.2～1.5份，络蛋白酸钙0.8～1.2份，磷酸氢二钾0.5～1.2份，氯化氨1～1.5份，硝酸钠1～1.3份，水400～500份。通过上述技术方案，解决了现有技术中由微生物发酵方法生产的中性蛋白酶的酶活力偏低的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种中性蛋白酶的制备方法
本专利技术属于发酵
，涉及一种中性蛋白酶的制备方法。
技术介绍
中性蛋白酶属于一种水解酶，能催化大分子蛋白质水解为小分子肽或氨基酸等产物，促进蛋白质的吸收和利用，由于其催化反应速度快、无工业污染、催化反应条件适应性宽等性质和优点，被广泛的应用于食品、饲料、化妆品、营养保健品、洗涤剂等行业。生产中性蛋白酶可以从动植物组织中提取，以植物作为蛋白酶的来源会受到一些诸如气候条件、可利用土地面积的大小等因素的影响，而以动物作为蛋白酶的来源,其产量的大小主要依赖可被屠宰牲畜的数量。由于从植物和动物中生产蛋酶具有局限性，为了满足当今世界市场的需要，人们越来越多地把目光投到微生物发酵上。微生物发酵菌种主要枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉菌、放线菌等。但是目前由微生物发酵生产中性蛋白酶的方式存在中性蛋白酶的酶活力偏低的问题。
技术实现思路
本专利技术提出一种中性蛋白酶的制备方法，解决了现有技术中由微生物发酵方法生产的中性蛋白酶的酶活力偏低的问题。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：A、将枯草芽孢杆菌种子液按照5～8％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，培养温度为25～28℃，培养时间为14～16h，得到初发酵液；B、向初发酵液中加入补料培养基补料，再次培养12～15h，得到发酵液；C、将发酵液经絮凝、精滤、超滤浓缩、加入稳定剂后得到中性蛋白酶成品；所述发酵培养基包括以下重量份的组分：<br>红薯淀粉30～50份，豆饼粉20～30份，南瓜粉5～10粉，腐殖酸镁1.2～1.5份，络蛋白酸钙0.8～1.2份，磷酸氢二钾0.5～1.2份，氯化氨1～1.5份，硝酸钠1～1.3份，水400～500份，所述发酵培养基的pH值为6.5-6.8。作为进一步的技术方案，所述补料培养基包括以下重量份的组分：甲醇0.5～1.5份，胡萝卜粉8～15份，虾壳粉5～10份，葡萄糖10～15份，甘油二酯0.5～1.2份。作为进一步的技术方案，所述絮凝具体为：向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，所述絮凝剂的添加量为发酵液体积的1.5％～2％。作为进一步的技术方案，所述絮凝剂由质量比为(0.5～1.2)：3的珍珠岩与硅藻土组成。作为进一步的技术方案，所述精滤具体为：向发酵液中加入海藻酸钠，经边框精滤机精滤，获得澄清滤液。作为进一步的技术方案，所述海藻酸钠的加入量为发酵液体积的2％。作为进一步的技术方案，所述超滤具体为用10000分子量超滤膜对澄清滤液进行超滤浓缩，得到浓缩液。作为进一步的技术方案，所述稳定剂由质量比为4：1的甘油与甘氨酸组成。作为进一步的技术方案，所述稳定剂的加入量为超滤浓缩后的浓缩液体积的15％。本专利技术的工作原理及有益效果为：1、本专利技术中，采用枯草芽孢杆菌发酵生产中性蛋白酶，通过对发酵过程中的发酵培养基和补料培养基的配方进行优化改进，显著提高了中性蛋白酶的酶活力，使得生产得到的发酵液中中性蛋白酶的酶活高至29574～29713U/mL，有效解决了现有技术中由微生物发酵方法生产的中性蛋白酶的酶活力偏低的问题。此外，本专利技术的制备方法得到的中性蛋白酶的耐热性显著提高，适宜在40～50℃下使用。2、本专利技术中，发酵培养基中除了发酵中必须的碳源和氮源外，还加入了南瓜粉、腐殖酸镁、络蛋白酸钙，显著提高了发酵液中中性蛋白酶的酶活力。南瓜粉中含有丰富的氨基酸、维生素、葡萄糖、无机盐等营养物质，促使枯草芽孢杆菌菌体快速生长，从而促进了发酵产镁量，同时，南瓜粉中还含有丰富的锌，提高了发酵过程中中性蛋白酶的稳定性，从而提高了中性蛋白酶的酶活力。腐殖酸镁与络蛋白酸钙相互配伍，进一步促进枯草芽孢杆菌发酵产酶，同时，提高了中性蛋白酶的稳定性，因此，提高了中性蛋白酶的酶活力。3、本专利技术中，在发酵14～16小时后加入补料培养基进行补料，补料培养基由甲醇、胡萝卜粉、虾壳粉、葡萄糖、甘油二酯组成，一方面，发酵14～16小时后，发酵培养基中的营养物质消耗过大，菌体生长速度下降，补料培养基中胡萝卜粉与虾壳粉、葡萄糖相互配伍，补充发酵过程所需的营养物质，从而促进菌体快速生长；另一方面，发酵过程中生产得到的中性蛋白酶不稳定，极易自溶，造成了中性蛋白酶酶活力的明显降低，而补料培养基中甲醇、胡萝卜粉、虾壳粉与甘油二酯协同配伍，大大的降低了中性蛋白酶的自溶，显著提高了发酵过程中中性蛋白酶的热稳定性，从而显著提高了中性蛋白酶的酶活力和热稳定性。4、本专利技术中，将发酵液经絮凝、精滤、超滤浓缩、加入稳定剂后得到中性蛋白酶成品，絮凝剂中珍珠岩与硅藻土相互配伍，有效去除了发酵液中除中性蛋白酶外的杂菌及杂质，再通过精滤、超滤浓缩、加入稳定剂等操作，显著提高了中性蛋白酶成品的纯度。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。下述枯草芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏CICC10071。枯草芽孢杆菌的种子液由以下步骤得到：取冷藏枯草芽孢杆菌冷藏菌株，用接种针挑取菌种接种到装有无菌水的试管中，震荡15min，然后用无菌吸管取0.5mL菌液加到斜面培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养20h；将培养后得到的菌液转接到灭过菌的种子培养基上培养，在35℃振荡培养18小时，得到枯草芽孢杆菌种子液。其中，斜面培养基包括以下重量份的组分：牛肉膏5份，蛋白胨10份，葡萄糖15份，琼脂16份，磷酸氢二钠0.5份，氯化钠2份，氯化钙1.5份，水1000份，斜面培养基的pH值为7；种子培养基包括以下重量份的组分：红薯淀粉3份，豆饼粉5份，磷酸氢二钠0.5份，氯化钾1份。实施例1一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：A、将枯草芽孢杆菌种子液按照5％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基包括以下重量份的组分：红薯淀粉40份，豆饼粉25份，南瓜粉7粉，腐殖酸镁1.3份，络蛋白酸钙1份，磷酸氢二钾0.7份，氯化氨1.2份，硝酸钠1.1份，水450份，发酵培养基的pH值为6.6；培养温度为27℃，培养时间为14h，得到初发酵液；B、向初发酵液中加入补料培养基补料，补料培养基包括以下重量份的组分：甲醇1份，胡萝卜粉10份，虾壳粉8份，葡萄糖14份，甘油二酯1.2份，再次培养15h，得到发酵液；C、向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，得到絮凝后的发酵液；其中，絮凝剂由质量比为1：3的珍珠岩与硅藻土组成，絮凝剂的添加量为发酵液体积的1.5％；将絮凝后的发酵液中加入海藻酸钠，经边框精滤机精滤，获得澄清滤液；海藻酸钠的加入量为发酵液体积的2％；用10000分子量超滤膜对澄清滤液进行超滤浓缩，得到浓缩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nA、将枯草芽孢杆菌种子液按照5～8％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，培养温度为25～28℃，培养时间为14～16h，得到初发酵液；/nB、向初发酵液中加入补料培养基补料，再次培养12～15h，得到发酵液；/nC、将发酵液经絮凝、精滤、超滤浓缩、加入稳定剂后得到中性蛋白酶成品；/n所述发酵培养基包括以下重量份的组分：/n红薯淀粉30～50份，豆饼粉20～30份，南瓜粉5～10粉，腐殖酸镁1.2～1.5份，络蛋白酸钙0.8～1.2份，磷酸氢二钾0.5～1.2份，氯化氨1～1.5份，硝酸钠1～1.3份，水400～500份，/n所述发酵培养基的pH值为6.5-6.8。/n

【技术特征摘要】
1.一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将枯草芽孢杆菌种子液按照5～8％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，培养温度为25～28℃，培养时间为14～16h，得到初发酵液；
B、向初发酵液中加入补料培养基补料，再次培养12～15h，得到发酵液；
C、将发酵液经絮凝、精滤、超滤浓缩、加入稳定剂后得到中性蛋白酶成品；
所述发酵培养基包括以下重量份的组分：
红薯淀粉30～50份，豆饼粉20～30份，南瓜粉5～10粉，腐殖酸镁1.2～1.5份，络蛋白酸钙0.8～1.2份，磷酸氢二钾0.5～1.2份，氯化氨1～1.5份，硝酸钠1～1.3份，水400～500份，
所述发酵培养基的pH值为6.5-6.8。


2.根据权利要求1所述的一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述补料培养基包括以下重量份的组分：
甲醇0.5～1.5份，胡萝卜粉8～15份，虾壳粉5～10份，葡萄糖10～15份，甘油二酯0.5～1.2份。


3.根据权利要求1所述的一种中性蛋白酶的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：程礼海，朱报常，颜学锋，汪东武，张少敏，
申请(专利权)人：内蒙古溢多利生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15