靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用。本发明专利技术首先提供了一种负载Survivin全抗原的DC细胞，其是将编码survivin全蛋白抗原的基因序列克隆至慢病毒载体上，用以转染可扩增树突状细胞，得到的呈递survivin全抗原的DC细胞。本发明专利技术进一步将负载Survivin全抗原的DC细胞与自体来源的PBMC细胞混合培养，获得大量高活性CTL细胞。通过杀伤实验表明，此群CTL细胞可高效杀灭携带survivin抗原的靶细胞，且其杀伤作用与HLA分子的匹配程度成正相关。

【技术实现步骤摘要】
靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于细胞免疫治疗
，具体而言，是关于一种靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
Survivin属于凋亡抑制蛋白（inhibitorofapoptosisprotein,IAP）家族成员，具有抑制细胞凋亡和调控细胞有丝分裂的双重功能，它是调控细胞周期和细胞凋亡的重要分子。已知survivin蛋白在多种肿瘤组织内呈现高表达的状态。研究表明，survivin在泌尿系统恶性肿瘤（膀胱癌，前列腺癌，宫颈癌，肾癌）中，其表达量与肿瘤恶性程度呈正相关。同时，研究发现Survivin在结直肠癌组织中的表达阳性率均明显高于癌旁正常组织，且与淋巴结转移呈正相关。在腺癌组织中，survivin表达与肿瘤细胞的分化程度呈负相关。这些信息提示survivin出现在肿瘤细胞的恶性转化早期，并在癌症恶化中起着重要的促进作用。因在肿瘤发生发展中的作用以及在癌组织中的高表达状况，survivin成为肿瘤治疗的潜在靶点。针对survivin蛋白的抗原多肽的研究目前主要集中在个别HLA位点限制性的几个多肽片段的研究，例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A1、HLA-A11、HLA-B35等位点与预测的多肽之间的研究。其基本的研发目标是寻找新的多肽-MHC位点，通过亲和力和杀伤活性的验证，将该多肽序列用于下一步的应用开发或将与多肽匹配的MHC克隆，应用于TCR-T等技术的开发。曾有学者通过腺病毒携带survivin全长序列转染DC细胞，然而并没有关于此技术survivin表达情况的现有技术报道。鉴于上述方法在实际应用中效用不佳以及高额的经济支出、时间成本以及结果的不确定性，研发新的效用强且资金、时间消耗低的针对Survivn靶点的T细胞疗法十分有必要。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种新的针对Survivn靶点的细胞免疫治疗技术。为达上述目的，本专利技术提供了一种靶向Survivin全蛋白抗原的DC细胞。由此，本专利技术首先提供了一种靶向survivin整个蛋白抗原的方法，将survivin全长基因序列插入到慢病毒载体上，通过慢病毒转染的方式使DC细胞负载并呈递survivin的各种多肽片段。进一步，本专利技术使所得负载survivin的DC细胞与HLA部分匹配或完全匹配的PBMC细胞进行共培养，以得到survivin抗原特异性的T细胞群，该群T细胞是涵盖多个抗原肽位点的T细胞的组合物，经验证具有高效的杀伤作用。本专利技术中，由于是将编码survivin蛋白全长的基因序列通过慢病毒转染负载于DC细胞，因此称转染后的DC细胞为负载survivin全抗原的DC细胞。从而，一方面，本专利技术提供了一种负载Survivin全抗原的DC细胞（DC-Survivin细胞）。在本专利技术的具体实施方案中，其是将编码survivin全蛋白的基因序列克隆至慢病毒载体上转染DC细胞而得到的呈递survivin全抗原的DC细胞。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的负载Survivin全抗原的DC细胞中，所述Survivin全蛋白包括SEQIDNo.2所示氨基酸序列。优选地，所述编码survivin全蛋白的基因序列包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列。另一方面，本专利技术还提供了所述的负载Survivin全抗原的DC细胞的制备方法，该方法包括：构建含有编码SEQIDNo.2所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体，转染可扩增树突状细胞，得到呈递survivin全抗原的DC细胞。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中所用的慢病毒载体例如可以是pCDH系列、pLVX系列载体。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中所用的DC细胞为可扩增树突状细胞。可以采用商购的具有可扩增性能的DC细胞，也可以按照现有技术记载的方法自行制备具有可扩增性能的DC细胞，例如，可将PBMC经PHA刺激后，经STLV1-4病毒中任一病毒的Tax基因转导后筛选得到DC细胞，该DC细胞即可具有可扩增性能，可以进一步培养扩增。本专利技术中对DC细胞的其他性能无特殊要求。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的负载Survivin全抗原的DC细胞的制备方法中，所述编码SEQIDNo.2所示氨基酸序列的基因为具有SEQIDNo.1所示序列的多核苷酸。根据本专利技术的具体实施方案显示，本专利技术的Survivin全抗原在DC细胞内的稳定、高效表达。区别于现有方法选择survivin蛋白内部一个或几个预测的可以和某一种HLA分子结合的多肽作为靶点，本法通过DC细胞自身表达、加工并形成的多肽-MHC的复合物，涵盖了该DC细胞所有HLA分子针对survivin蛋白的所有可能的多肽-MHC组合，最终使该DC疫苗或由其诱导生成的CTL细胞具备靶点多样性，有利于对癌细胞的彻底清除。本专利技术的方法制备的DC-Survivin细胞，不仅可以用于自体T细胞的诱导，还可以用于诱导异体配型的T细胞。在本法中验证的是HLA-0201和HLA-A2402两种类型，其中HLA-A0201在中国人群中的占比为18-45%，HLA-2402在人群中的占比为25%，而同时表达HLAA0201和HLA-A240的人群约为11.5%。这些人群应用本法中的异体DC细胞理应取得一定的效果。在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术的携带survivin全抗原的DC细胞可制备为癌症治疗性疫苗，针对survivin阳性的各类癌症。在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术的携带survivin全抗原的DC细胞，在体外诱导的survivin特异性细胞毒T细胞，用于过继性T细胞治疗癌症。另一方面，本专利技术还提供了所述的负载Survivin全抗原的DC细胞在制备Survivin蛋白抗原特异性的免疫细胞组合物中的应用。另一方面，本专利技术还提供了一种免疫细胞，其是由本专利技术的负载Survivin全抗原的DC细胞诱导产生的。根据本专利技术的一些具体实施方案，所述免疫细胞包括CTL细胞；根据本专利技术的一些具体实施方案，所述免疫细胞是由本专利技术所述的负载Survivin全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养获得的。根据本专利技术的一些具体实施方案，本专利技术所述的负载Survivin全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养时，按照DC细胞：PBMC=1:5~1:500的量混合培养。优选地，可向培养体系中加入200~1000unit/ml的白介素2。另一方面，本专利技术还提供了一种试剂盒，其包括：编码SEQIDNo.2所示氨基酸序列的基因或扩增该基因的引物，含有编码SEQIDNo.2所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体，和/或本专利技术所述的负载Survivin全抗原的DC细胞。所述试剂盒还可包括转染试剂或所属领域中的常规试剂等。本专利技术的试剂盒可用于制备所述的Survivin蛋白抗原特异性的免疫细胞组合物。综上所述，本专利技术提供了一种靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种负载Survivin全抗原的DC细胞，其是将编码survivin全蛋白的基因序列克隆至慢病毒载体上转染可扩增DC细胞而得到的呈递survivin全抗原的DC细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种负载Survivin全抗原的DC细胞，其是将编码survivin全蛋白的基因序列克隆至慢病毒载体上转染可扩增DC细胞而得到的呈递survivin全抗原的DC细胞。


2.根据权利要求1所述的负载Survivin全抗原的DC细胞，其中，所述Survivin全蛋白包括SEQIDNo.2所示氨基酸序列。


3.根据权利要求2所述的负载Survivin全抗原的DC细胞，其中，所述编码survivin全蛋白的基因序列包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列。


4.权利要求1-3任一项所述的负载Survivin全抗原的DC细胞的制备方法，该方法包括：
构建含有编码SEQIDNo.2所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体，转染可扩增DC细胞，得到呈递survivin全抗原的DC细胞。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述编码SEQIDNo.2所示氨基酸序列的基因具有SEQIDNo.1所示核苷酸序列。


6.权利要求1-3任一项所述的负载Survivin全抗原的DC细胞在制备Survivin蛋白抗原特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：张欢，程铧，
申请(专利权)人：北京翊博普惠生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11