引发免疫排斥反应在肿瘤治疗中的应用及其方法技术

本发明专利技术属于生物医学工程技术领域，具体涉及引发免疫排斥反应在肿瘤治疗中的应用及其方法，所述的引发免疫排斥反应是通过移植异体免疫细胞引发的免疫排斥反应。通过引发免疫排斥反应用于肿瘤治疗的方法，具体包括分选CD4

【技术实现步骤摘要】
引发免疫排斥反应在肿瘤治疗中的应用及其方法
本专利技术属于生物医学工程
，具体涉及引发免疫排斥反应在肿瘤治疗中的应用及其方法。
技术介绍
近年来，全球范围内癌症的发生率和死亡率迅速增加，成为大部分地区导致人口死亡的主要因素之一。2018年国际癌症研究机构针对185个国家、36种肿瘤研究数据显示，全球大约有1810万新发癌症病例，960万癌症死亡病例，是人类亟待攻克的难题之一。传统的治疗肿瘤的方法主要包括手术、化疗、放疗、肿瘤靶向药物治疗。通过手术能够直接切除某些实体肿瘤的原发及转移灶，但无法从根本上控制肿瘤细胞的转移和肿瘤的复发。放疗和化疗分别是利用放射线和化学药物来杀灭肿瘤细胞，其疗效取决于肿瘤细胞的放射敏感性和化疗药物敏感性，尽管能够直接杀灭对治疗敏感的肿瘤细胞，但在治疗过程中常伴随对机体正常组织细胞难以控制的损伤，而且也会产生严重的毒副作用和耐药性，导致治疗窗口窄和有效性低，使得肿瘤患者在治疗过程中要承受很大的痛苦。肿瘤免疫疗法是近年来发展起来的肿瘤治疗新方法，具有疗效好、安全性高、副作用小以及耐药性低等诸多优点。目前肿瘤免疫疗法主要包括免疫检查点阻断剂疗法、过继细胞疗法、肿瘤疫苗等。但该领域还存在着以下问题：1)由于患者个体化差异、肿瘤异质性、肿瘤微环境差异等特点，肿瘤免疫治疗整体有效率还比较低，受众人群偏少；2)多数基于PD-1/PD-L1的联合用药策略，尚缺乏临床证据以及基础理论支持；3)除了PD-1/PD-L1信号通路，对其他免疫逃逸机制的研究还不够深入，针对此类靶点开发治疗药物尚有一定距离。4)肿瘤免疫治疗目前过程复杂、治疗费用高。免疫排斥是指机体对移植物(异体细胞、组织或器官)通过特异性免疫应答使其破坏的过程。一般是指移植术后，受者可识别移植物抗原并产生应答，移植物中免疫细胞也可识别受者抗原组织并产生应答。临床上经常应用自体或异体的正常细胞、组织、器官置换病变或功能缺损的部分，以维持和重建机体的生理功能，但伴随的免疫排斥反应严重阻碍细胞、组织、器官移植技术在临床上的应用。在器官移植中，通常通过降低供体组织相容性抗原免疫原性或降低受者细胞免疫强度来降低免疫排斥反应促进器官移植的存活，为治疗肝脏、肾脏和心脏等慢性终末期疾病提供了有效方法。因此目前的研究主要是针对如何降低免疫排斥反应，开发一些免疫抑制剂等，还未发现免疫排斥反应对机体正面的作用。而且目前未发现有利用免疫排斥治疗肿瘤的相关研究，本专利技术通过异源免疫细胞的移植，诱导机体内免疫排斥反应来用于肿瘤治疗。免疫排斥反应除了通过其效应细胞发挥抗肿瘤反应外，也可以通过诱导肿瘤细胞特异的CD8+T细胞，发挥特异性的抗肿瘤免疫反应，提高自身免疫细胞对肿瘤的识别和杀伤作用，有效降低肿瘤的免疫逃逸，更好的调动机体的免疫系统定向参与到肿瘤治疗。目前与本专利技术专利最相近似的实现方案是肿瘤的免疫疗法中的过继细胞疗法，过继细胞疗法是通过输入在体外扩增的或经加工处理的免疫细胞促进宿主抗肿瘤免疫，发挥直接的抗肿瘤作用，从而治疗晚期难治性肿瘤的一种生物学方法。目前有3种方法应用T细胞进行肿瘤过继治疗：①从患者肿瘤组织标本中获得的肿瘤浸润淋巴细胞；②通过基因工程方法改造TCR-T或CAR-T；③从患者外周血中分离扩增自身T细胞。这几种方法是通过同一个个体自身分离的T细胞经过扩增或者改造后回输到自己体内发挥抗肿瘤的作用，避免过继的细胞引起免疫排斥反应。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题本专利技术从异体获得的T细胞直接用于肿瘤治疗，不是避免，而是利用免疫排斥反应。巧妙的利用机体自身的免疫排斥反应来实现对肿瘤的治疗作用，方法简单易操作，可以避免现有方法的缺点，为肿瘤的治疗提供新的思路和方法。为了实现上述目的，本专利技术采取如下技术方案：引发免疫排斥反应在肿瘤治疗中的应用，所述的引发免疫排斥反应是通过移植异体免疫细胞引发的免疫排斥反应。一种通过引发免疫排斥反应用于肿瘤治疗的方法，具体包括如下步骤：1.分选CD4+T细胞1.1研磨脾脏，制备细胞悬液备用。1.2与分选小鼠CD4+T细胞的磁珠结合将上述1.1得到的细胞悬液与分选小鼠CD4+T细胞的磁珠混匀，冰上孵育30分钟，加入PBS，离心，弃上清，重悬备用。1.3润洗MS分选柱加入5mlPBS于分离柱内，使液体自然流过。1.4上样将1.2中孵育好的细胞悬液加入到1.3中润洗好的分选柱中，使液体自然流过，待样品全部流过，再加入5mlPBS冲洗分选柱。1.5分离结合的CD4+T细胞待冲洗结束后，取下分离柱放于新的15ml离心管中，加入2.5mlPBS用推送器迅速洗脱细胞，然后重复洗脱一次。1.6将1.5得到的细胞悬液于1000rpm离心5min，重悬细胞并计数，调整细胞浓度为4*107/ml。2.注射CD4+T细胞：瘤内注射步骤1中分选的CD4+T细胞，采取多点注射。或者尾静脉注射进荷瘤小鼠体内。本专利技术的有益效果为：1)本专利技术所需细胞制备简单，无需进行体外扩增培养，而且异体移植外源细胞基本都会导致受体产生免疫排斥反应，治疗有效率高，具有普遍性。2)本专利技术提供的这类免疫排斥疗法巧妙的利用机体的免疫排斥反应来实现对肿瘤的治疗作用，为肿瘤的治疗提供新方法。附图说明图1为实验技术路线图；图2为肿瘤大小示意图；图3为肿瘤重量示意图；图4为肿瘤中CD4+T细胞比例图；图5为肿瘤中CD8+T细胞比例图；图6为外周血中CD8+T细胞比例图。具体实施方式为了便于理解，下面结合附图，通过实施案例，对本专利技术技术方案作进一步具体描述：如图1-图6所示，一种通过引发免疫排斥反应用于肿瘤治疗的方法，具体包括如下步骤：1.复苏小鼠结直肠癌MC38细胞系并进行传代、接种从液氮容器中取出冻存管，迅速浸入37℃温水中，不时晃动使其尽快融化；融化后迅速转移至超净工作台，用75％酒精表面消毒，打开盖子，吸出细胞悬液，转移到无菌离心管并加入10倍含10％胎牛血清的1640培养基；混匀后1000rpm离心5min；弃去上清液，加入含10％胎牛血清的1640培养基，重悬细胞，混匀后转移到10cm培养皿中；37℃，5％CO2培养箱静置培养；次日更换一次培养液，继续培养。观察细胞状态，细胞铺满板后进行传代，传代2至3次，使细胞处在最佳状态。用含0.25％EDTA的胰酶消化细胞，用PBS洗细胞两遍，去除所有培养基，用PBS重悬，进行细胞计数。调整细胞浓度为2*107/ml，取100ul细胞悬液接种于C57BL/6小鼠背部，建立荷瘤小鼠模型,接种细胞数为2×106/只。2.分选CD4+T细胞2.1研磨脾脏从超净工作台内取C57BL/6与BALB/c小鼠脾脏，放于无菌的培养皿中，加入2ml预冷的PBS并进行研磨。将研磨完的细胞悬液用200目的滤网过滤进15ml离心管内，加入10mlPBS，1000rpm离心5mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引发免疫排斥反应在肿瘤治疗中的应用，其特征在于：所述的引发免疫排斥反应是通过移植异体免疫细胞引发的免疫排斥反应。/n

【技术特征摘要】
1.引发免疫排斥反应在肿瘤治疗中的应用，其特征在于：所述的引发免疫排斥反应是通过移植异体免疫细胞引发的免疫排斥反应。


2.根据权利要求1所述的引发免疫排斥反应在肿瘤治疗中的应用，其特征在于：所述的异体免疫细胞为同物种异体来源的CD4+T细胞。


3.根据权利要求2所述的引发免疫排斥反应在肿瘤治疗中的应用,其特征在于：异体来源的免疫细胞为人工提取分离的同物种异体来源的CD4+T细胞。


4.通过引发免疫排斥反应用于肿瘤治疗的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：1)分选CD4+T细胞，2)注射CD4+T细胞。


5.根据权利要求4所述的通过引发免疫排斥反应用于肿瘤治疗的方法，其特征在于：步骤1)具体包括如下步骤：
1.1研磨脾脏，制备细胞悬液备用；
1.2与分选小鼠CD4+T细胞的磁珠结合
将上述1.1得到的细胞悬液与分选小鼠CD4+T...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊化保，闫风连，朱玉贞，张惠，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37