一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PSA基因突变的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PSA基因突变的试剂盒及检测方法，所述的试剂盒包括稀释液、脱色液、染色液A、染色液B、鼠抗人PSA一抗、标记有碱性磷酸酶的兔抗鼠二抗、0.1%Triton X‑100、0.3%H

【技术实现步骤摘要】
一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PSA基因突变的试剂盒及检测方法
本专利技术提供了一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PSA基因突变的试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
在世界范围内，前列腺癌发病率居男性恶性肿瘤第2位，癌症特异性死亡居第6位。2015中国肿瘤登记年报显示，2011年中国前列腺癌发病率居恶性肿瘤第9位，城市男性前列腺癌的发病率和死亡率在男性恶性肿瘤中分别居第6位和第9位。前列腺癌治疗的难点是转移性前列腺癌，尤其是内分泌治疗后出现的去势抵抗现象，目前转移性前列腺癌去势抵抗后的治疗手段有限，并且会出现所有的常规治疗手段（放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗）都失效的情况。随着分子生物学的发展，中晚期前列腺细胞癌的免疫治疗逐渐兴起，初步的临床试验也取得了较好的疗效，目前多项III期临床试验正在开展。1979年首次报道血清前列腺特异性抗原(prostate．specificantigen，PSA)可作为前列腺癌的诊断工具，目前，PSA对前列腺癌的诊断作用、疾病恶性程度以及预后的判断在欧美等发达国家已经有较深入的研究。PSA是主要由位于前列腺的腺泡和导管内前列腺上皮细胞产生的一种糖蛋白，主要集中在前列腺组织内，正常情况下PSA在血清的中的水平是非常低的。导致正常前列腺上皮结构破坏的任何疾病如前列腺疾病，炎症或外伤等都可以引起前列腺组织内的PSA漏出，并大量进入血循环导致血清PSA升高。血清PSA水平已成为前列腺癌检测的一个重要标志物。目前，国内外前列腺癌诊治指南均认为：前列腺癌PSA突变检测的时间点包括初诊时及争取在疾病进展时再次检测，应通过重复检测减少假阳性和假阴性。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。针对目前临床实践中，前列腺癌患者PSA检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)PSA表达情况对前列腺癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东凯歌智能机器有限公司就循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术、检测设备、试剂盒开发与生产进行合作，山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位进行推广应用，本项目为山东省重大科技创新工程项目，以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东凯歌智能机器有限公司、山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行研发与推广。
技术实现思路
针对现有技术中的检测肿瘤晚期或复发前列腺癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者PSA实时动态状态，及现有检测方法容易出现假阳性和假阴性的缺点，本专利技术提供了一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PSA基因突变的试剂盒及检测方法：利用膜过滤装置分离获得晚期前列腺癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用免疫组化技术检测CTC上PSA表达情况。本专利技术通过以下技术方案实现：一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PSA基因突变的试剂盒，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、鼠抗人PSA一抗100μL、标记有碱性磷酸酶的兔抗鼠二抗100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A1mL。优选地，所述稀释液为1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.3%硫酸铁+0.5%蔗糖。优选地，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。优选地，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。优选地，所述试剂A为乙醇和多聚甲醛按照体积比3：1组成。本专利技术中，使用所述的试剂盒非诊断目的检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PSA基因突变的方法，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发前列腺癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发前列腺癌患者肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（5）运用免疫组化技术检测外周血CTC的PSA表达情况。优选地，其特征在于，步骤（5）所述检测外周血CTC的PSA表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；（2）滴加100μl0.1%TritonX-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；（3）滴加100μl0.3%H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μl鼠抗人PSA一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；（5）滴加100μl标记有碱性磷酸酶的兔抗鼠二抗，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；（6）滴加100μlDAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；（9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇（1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PSA基因突变的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、鼠抗人PSA一抗100μL、标记有碱性磷酸酶的兔抗鼠二抗100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H

【技术特征摘要】
1.一种检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PSA基因突变的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、鼠抗人PSA一抗100μL、标记有碱性磷酸酶的兔抗鼠二抗100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A1mL。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.3%硫酸铁+0.5%蔗糖。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A为乙醇和多聚甲醛按照体积比3：1组成。


6.一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒非诊断目的检测前列腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PSA基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发前列腺癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发前列腺癌患者肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；
（4）...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯景阳，李文涛，李琛琛，洪瑛，
申请(专利权)人：山东凯歌智能机器有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37