用于测定内毒素的改善的细菌内毒素测试制造技术

本文报道了一种测定抗体(使用细菌细胞产生的抗体)样品中低浓度的细菌内毒素的方法，其按照以下顺序包括以下步骤：i)向样品中加入镁离子，ii)稀释样品，iii)相对于无内毒素的水溶液透析具有pH值5.7‑8.0的样品，和iv)使用细菌内毒素测试，特别是鲎变形细胞溶解物测定法，测定样品中的细菌内毒素。

【技术实现步骤摘要】
用于测定内毒素的改善的细菌内毒素测试本申请是申请日为2016年7月27日的、专利技术名称为“用于测定内毒素的改善的细菌内毒素测试”的中国专利申请201680044156.7(PCT/EP2016/067896)的分案申请。
本文报导了细菌内毒素测试(BET)样品制备方法，其克服了由于内毒素屏蔽导致的低内毒素回收(LER)效应。
技术介绍
蛋白质疗法(如单克隆抗体)通常使用遗传转化的真核和原核细胞(如细菌)产生。用于细菌生产的是快速生长的细菌，如大肠杆菌(Escherichiacoli)。然而，在重组蛋白的生长和培养期间，高毒性的脂多糖(LPS)分泌到培养基中。这些组分被称为细菌内毒素(简写内毒素)。革兰氏阴性细菌具有LPS作为其细胞壁的重要组分。革兰氏阴性细菌细胞含有约3.5x105个LPS分子，占据的总面积约4.9μm2(Rietschel,1994,FASEBJ.8：217-225)。在大肠杆菌的情况下，这意味着LPS占总细菌细胞表面的约四分之三。大约10,000CFU(集落形成单位)的革兰氏阴性细菌种对应于1个内毒素单位(EU)(Rietschel,1994,FASEBJ.8：217-225)。EU指内毒素/LPS；取决于所使用的LPS，1EU≈100pgLPS。然而，即使产品不是通过重组手段生产的，大多数使用的试剂也被内毒素污染，这是因为它们的生产很少在消毒(aseptic)甚至无菌(sterile)条件下进行。因此，如果在药物生产过程中不能保持无菌和/或消毒条件，LPS是无处不在的潜在污染物。在所有已知的细菌化合物中，内毒素是对哺乳动物毒性最大的天然化合物之一。已知存在于革兰氏阴性细菌细胞壁中的LPS引起深度的免疫激活，包括进入人类血流时引起发热。当分别进入心血管和淋巴系统时，其在极低的浓度(皮克范围)下引起神志不清效应。不幸的是，细菌内毒素是热稳定的，其毒性与细菌细胞的存在毫不相关。通常还知道无论其生产方法如何，所有的蛋白治疗剂都必定会被预期或被认为存在低痕量的细菌内毒素(所谓的“天然存在的内毒素”，NOE)污染。因此，内毒素污染对于生产如治疗性单克隆抗体等药物仍然是一个持续的挑战。这在食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)于2012年6月发布的“GuidanceforIndustry,pyrogenandendotoxintesting”中已经非常清楚地列出。为确保可注射的蛋白治疗剂(如单克隆抗体)对人使用是安全的，必须进行内毒素测试。内毒素测试通常使用美国药典<85>、欧洲药典2.6.14或日本药典4.01中的药典方法，用凝胶-凝结(gel-clot)、显色或浊度鲎血变形细胞溶解物(Limulusamoebocytelysate，LAL)技术(也称为LAL测定试验或LAL测试)进行。LAL测定试验的药典名称是细菌内毒素测试(BET)。BET用于检测给定样品或物质中不安全水平的内毒素的存在，特别是革兰氏阴性细菌内毒素。通常用稀释的测试样品与阳性对照一起进行LAL测定试验，阳性对照是具有已知量的掺入对照标准内毒素(CSE)的样品。CSE是商业上可获得的确定形式的内毒素(例如由Lonza,AssociatesofCapeCod,Inc.(ACC),或CharlesRiverLaboratoriesInternational,Inc.提供)。根据药典LAL测定试验的限定条件，CSE以非干扰浓度(NIC)掺入(spiked)到稀释样品中以实现50-200％的可接受的回收率。该方法未能认识到，药物制剂样品基质的组分以及存储条件潜在地影响未稀释产品样品中存在的内毒素的LAL反应性。当未稀释的产品样品中掺入内毒素如CSE后进行LAL测定时，对某些生物产品观察到低的内毒素回收率(<50％)。如果产品制剂含有两亲化合物如洗涤剂时，则尤其观察到这种低的内毒素回收。将洗涤剂加入到产品中以溶解治疗性蛋白。这种内毒素屏蔽导致内毒素检测的显著降低，特别是在LPS污染低的情况下。如果掺入后内毒素回收不能通过样品稀释而增加，这种现象被称为“内毒素屏蔽”。已知用于LAL测定试验以克服测定试验的抑制和/或增强的不同样品预处理。但是，目前这些样品预处理并不能产生令人满意的结果。因此，仍然存在在药物制造期间发生由于内毒素屏蔽而不能被LAL测定试验检测到的内毒素污染的风险。根据目前的知识，有两种不同类型的内毒素屏蔽：1)由样品中存在的内毒素结合蛋白引起的内毒素屏蔽(“蛋白屏蔽”，Petsch,Anal.Biochem.259,1998,42-47)。例如，众所周知，与例如人脂蛋白ApoA1、溶菌酶、核糖核酸酶A或人IgG形成蛋白-内毒素聚集体，降低内毒素的LAL反应性(Emancipator,1992；Petsch,Anal.Biochem.259,1998,42-47)。2)由药物产品中经常存在的某些制剂成分或缓冲液组分引起的内毒素屏蔽。例如，由聚山梨醇酯加上柠檬酸盐或磷酸盐的组合特异地引起的内毒素屏蔽被称为“低内毒素回收(LowEndotoxinRecovery)”或LER(Chen,J.andWilliams,K.L.,PDALetter10,2013,14-16,Williams,AmericanPharmaceuticalReview,October28,2013：EndotoxintestConcernsofBiologics)。内毒素屏蔽也可以由任何其它缓冲液组分和非离子型洗涤剂或其组合引起。由于LER效应，当使用常规的LAL测定试验时，在制造期间发生的潜在内毒素污染仍然被低估或未被检测到。LER效应是对药物产品的一个持续挑战(Hughes,BioPharm.AsiaMarch/April2015,14-25)。因此，本专利技术的技术问题是提供克服LER效应的手段和方法。
技术实现思路
如下所述，通过本专利技术的方法已经克服了该技术问题。本文报道了用于定量内毒素的改善LAL测定试验。这种改善的LAL测定试验特别可以用于两亲性基质屏蔽内毒素测定(低内毒素回收(Low-Endotoxin-Recovery)；LER)的情况。特别是，在本专利技术的上下文中，令人惊奇地发现，通过向样品中加入镁离子(例如以MgCl2形式)；稀释样品；和透析具有pH值5.7-8.0的样品的顺序，可以成功克服LER效应。或者换言之，本文报道的样品制备方法适用于克服LAL测定试验中的LER效应。更具体地说，在本专利技术的上下文中，已经发现了用于包含抗体的样品(例如治疗性单克隆抗体样品)的样品制备方法。本专利技术的样品制备方法具有如下优点：如果进行LAL测定试验，其令人惊奇且意想不到地消除了LER效应。更具体地，本专利技术涉及制备包含抗体的样品用于BET(优选用于LAL测定试验)的方法，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：(a)向样品中加入镁离子，优选以MgCl2形式，(b)稀释样品，和(c)相对于无内毒素的水溶液透析具有pH值5.7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于在包含抗体的样品的鲎变形细胞溶解物(LAL)测定法中减少内毒素屏蔽和/或克服低内毒素回收(LER)效应的方法，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：/n(a)向样品中加入镁离子，优选以MgCl

【技术特征摘要】
20150728 EP 15178683.71.用于在包含抗体的样品的鲎变形细胞溶解物(LAL)测定法中减少内毒素屏蔽和/或克服低内毒素回收(LER)效应的方法，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：
(a)向样品中加入镁离子，优选以MgCl2形式，
(b)稀释样品，和
(c)相对于无内毒素的水溶液透析具有pH值5.7-8.0的样品。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是制剂样品。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述内毒素屏蔽和/或所述LER效应由
(i)所述样品中存在的内毒素结合蛋白；和/或
(ii)制剂成分或缓冲液组分
引起。


4.根据权利要求3所述的方法，其中制剂成分或缓冲液组分包含两亲化合物如非离子型洗涤剂与柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液的组合。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述非离子型洗涤剂是聚山梨醇酯，优选聚山梨醇酯80。


6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中所述镁离子以MgCl2形式加入。


7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中镁离子加入至终浓度大约10-100mM，优选25-75mM。


8.根据权利要求1所述的方法，其中抗体用聚山梨醇酯80和柠檬酸盐缓冲液配制。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述抗体用约25mM柠檬酸钠缓冲液和约700mg/l聚山梨醇酯80配制，并具有约6.5的pH值。


10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括通过在包含抗体的样品的等分试样中掺入已知量的内毒素来产生低内毒素回收(LER)阳性对照。


11.根据权利要求10所述的方法，其中，如果不进行权利要求1的方法的步骤(a)至(c)，所述LER阳性对照显示LER效应。


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【专利技术属性】
技术研发人员：C·亚历山大，S·多伊奇曼，P·朗，F·范温钦杰罗德，U·策林格，
申请(专利权)人：博斯特尔莱布尼茨林根岑特鲁姆研究中心，豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE