本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，属于生物检测技术领域，本发明专利技术试剂盒包括酶标板、底物液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、酶结合物和终止液，酶标板预包被新型冠状病毒S+N重组蛋白，酶结合物为为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA/IgM/IgG‑HRP抗体稀释液，通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，以定性判定测试样本中是否存在新型冠状病毒抗体，具有高灵敏度和高特异性；本发明专利技术试剂盒通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，具有高特异性、准确性强的特点，步骤简便，设计合理，适合推广。
【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒
本专利技术涉及生物检测
，特别是涉及一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒。
技术介绍
新型冠状病毒(2019-nCoV)常见体征有发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，而部分患者症状轻微，甚至存在无临床症状的患者，具备人传人的特点，一般潜伏期1-14天，且潜伏期具有传染性，而无症状感染者也可能成为传染源，其主要通过呼吸道飞沫和密切接触传染传播，人群普遍易感。目前，2019-nCoV核酸检测是诊断COVID-19的常规检测方法和确诊依据。然而，受样本采集与存放、病毒感染的部位、RNA提取方法以及核酸检测试剂盒质量问题等多方面因素影响，核酸检测存在假阴性的问题。随着2019-nCoVIgM和IgG抗体免疫检测试剂盒的研发，抗体检测可以非常有效地弥补核酸检测漏检的风险，在COVID-19及时诊治及防控中发挥重大的实验室诊断价值。目前，用于2019-nCoVIgM/IgG抗体检测的方法和相应的试剂盒，有一定的研究和报道，也有一定的产品上市。现有检测2019-nCoV抗体的方法包括普通ELISA方法、荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法等均有一定的缺点。普通ELISA试剂盒多用原核表达的重组蛋白或培养的全病毒做包被抗原，但其灵敏度和特异性较低。因此，由于2019-nCov-SARS的特殊性质，亟需研发一种特异性好、灵敏度高的新型冠状病毒ELISA检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，该试剂盒采用His+N蛋白基因+甘氨酸柔性肽+S蛋白基因插入到PET-28a载体中构建成原核表达载体获取重组蛋白，将其包被微孔板，组成2019-nCoVIgA/IgM/IgG抗体的试剂盒，该试剂盒除了具有普通ELISA检测试剂盒的优点外，还弥补了重组抗原导致的灵敏度低的缺点，提高了检测的灵敏度和特异性。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，包括酶标板、底物液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、酶结合物和终止液，所述酶标板预包被新型冠状病毒S+N重组蛋白；所述酶结合物为用酶标稀释液按工作浓度配制的鼠抗人IgA/IgM/IgG工作液。进一步地，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA/IgM/IgG-HRP抗体稀释液。进一步地，所述新型冠状病毒使用质量浓度1-10％的牛血清蛋白封闭后包被。进一步地，所述新型冠状病毒的包被量为0.1μg/well。进一步地，所述样品稀释液为含质量分数1-10％牛血清蛋白的pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。进一步地，所述浓缩洗涤液为含体积分数0.05％吐温-20的pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。进一步地，所述阳性对照液为在样品稀释液中按1:30～1:100的比例加入阳性血清制成，阳性对照液的吸光度值大于1.0；所述阴性对照血清为在样品稀释液中，按5wt％的比例加入阴性血清制成，阴性对照液的吸光度值小于0.1。进一步地，所述新型冠状病毒S+N重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)根据GenBank中报道的SARS-COV-2的N和S蛋白基因序列，设计特异性引物，分别用于N和S蛋白两种基因的扩增；通过目的片段扩增、酶切、连接和转化，将N蛋白基因+甘氨酸柔性肽+S蛋白基因+His基因插入到PET-28a载体中，得到含有N和S蛋白基因序列的质粒，序列如SEQIDNo.1所示，N蛋白基因全长1257bp，编码419个氨基酸，S蛋白基因全长1479bp，编码493个氨基酸；(2)将含有N和S蛋白基因序列的质粒，使用大肠杆菌进行蛋白表达，将菌体超声后，取沉淀用50mMTris+2M尿素pH＝12进行过夜溶解后，离心，取上清透析至pH＝9.5的Tris溶液中获取蛋白；透析步骤如下：将NTA树脂装入层析柱，将目标蛋白加到NTA层析柱中，并用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗涤，流速15mL/h，收集穿透部分，然后分别用5倍NTA体积NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-100和NTA-500洗脱，流速15mL/h，收集洗脱液；(3)SDS/PAGE进行分析确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况，收集目的蛋白。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒采用His+N蛋白基因+甘氨酸柔性肽+S蛋白基因插入到PET-28a载体中构建成原核表达载体获取重组蛋白，将其包被微孔板，组成2019-nCoVIgA/IgM/IgG抗体的试剂盒，该试剂盒除了具有普通ELISA检测试剂盒的优点外，还弥补了重组抗原导致的灵敏度低的缺点，提高了检测的灵敏度和特异性。本专利技术试剂盒包括酶标板、底物液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、酶结合物和终止液，酶标板预包被新型冠状病毒S+N重组蛋白，酶结合物为为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA/IgM/IgG-HRP抗体稀释液，通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，以定性判定测试样本中是否存在新型冠状病毒抗体，具有高灵敏度和高特异性。本专利技术的新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，通过抗原抗体的免疫特异性反应进行检测，具有高特异性、准确性强的特点，步骤简便，设计合理，适合推广。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1的重组蛋白的SDS/PAGE电泳图。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。在不背离本专利技术的范围或本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，包括酶标板、底物液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、酶结合物和终止液，其特征在于，所述酶标板预包被新型冠状病毒S+N重组蛋白；/n所述酶结合物为用酶标稀释液按工作浓度配制的鼠抗人IgA/IgM/IgG工作液。/n
【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，包括酶标板、底物液、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、酶结合物和终止液，其特征在于，所述酶标板预包被新型冠状病毒S+N重组蛋白；
所述酶结合物为用酶标稀释液按工作浓度配制的鼠抗人IgA/IgM/IgG工作液。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA/IgM/IgG-HRP抗体稀释液。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒使用质量浓度1-10％的牛血清蛋白封闭后包被。
4.根据权利要求3所述的新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒的包被量为0.1μg/well。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含质量分数1-10％牛血清蛋白的pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含体积分数0.05％吐温-20的pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA/IgM/IgG抗体ELISA检测试剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：王震，吕建新，李凯强，郝珂，陈林洁，李凯旋，
申请(专利权)人：浙江省人民医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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