一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法技术

本发明专利技术提供了一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，包括制备供试品溶液、制备对照品溶液、高效液相色谱分析、测定等步骤。本发明专利技术具有操作简单、稳定、灵敏、准确度高、重复性好等优点，能从色谱的整体特征面貌上较全面的反映明日叶的成分，准确地评价明日叶药材的质量，可较全面地对明日叶的内在质量进行控制与评价，监控明日叶药材的质量及鉴别真伪，确保药材的真实、安全、有效、稳定和一致性，为进一步开发、制定其中药材标准提供参考依据，规范、保障临床用药。

【技术实现步骤摘要】
一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法
本专利技术属于中药材指纹图谱的构建方法的领域，具体涉及一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法。
技术介绍
中药虽然已经有几千年的应用发展历史，但如何有效的评价中药材质量的真伪、优劣，一直是中药材研究与应用的重点和难点。随着科技的发展，指纹图谱质控技术在中药领域被提出并得到广泛认可，其在中药材质控中的应用也越来越多；中药材指纹图谱是指中药材经过适当处理后，采用一定的分析手段和检测仪器得到的，能够标示该中药材特性的图谱，它是现阶段可以较全面地反映中药材内在质量的最有效的手段之一，也得到了国际社会的认可。明日叶(AngelicakeiskeiKoidzumi)，为伞形科当归属草本植物，原产于日本八丈岛，因今日摘叶，明天又长新芽因此而得名；现明日叶种植主要分布于广西、云南、贵州及台湾等南方地区；主要成分含有黄酮类、香豆素类、萜烯类等，具有抗衰老、抗溃疡、抗血栓、抗癌；降血压、降血脂、降血糖、降胆固醇；改善睡眠、改善视力等作用。近年来学者对明日叶的化学成分、提取分离与纯化，药理活性，明日叶的价值与开发等进行研究。中药指纹图谱能对中药材较复杂化学成分进行分类进行全面的分析；HPLC指纹图谱简便准确、灵敏度高、重复性好、检测种类多、分析快速是目前应用较为广泛的方法。目前关于明日叶的指纹图谱研究较少，历年的《中国药典》均未见收载，缺少对体现整体特性的研究，缺乏全面地控制药材质量的方法，从化学物质基础角度保证中药制剂的稳定性和可靠性，因此建立明日叶指纹图谱，对明日叶的质量评价具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：针对上述存在的不足，提供一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，该方法具有操作简单、稳定、灵敏、准确度高、重复性好等优点，能从色谱的整体特征面貌上较全面的反映明日叶的成分，为明日叶质量控制提供了新的科学方法，弥补了现有质量控制技术的不足。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：S1：制备供试品溶液：称取明日叶样品制成供试品溶液，备用；S2：制备对照品溶液：分别称取绿原酸对照品和木犀草苷对照品，分别制成绿原酸对照品溶液、木犀草苷对照品溶液和混合对照品溶液，备用；S3：高效液相色谱分析：将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，在高效液相色谱检测条件下进行分析，将得到的高效液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到明日叶的指纹图谱；所述高效液相色谱检测条件如下：采用ULtimateXB-C8色谱柱；以流动相A为甲醇，流动相B为0.1～0.3%甲酸为流动相进行梯度洗脱，柱温25～35℃，流速0.8～1.2mL/min，检测波长190～400nm，分析时间35min，进样量10μL，洗脱梯度程序：0～20min时，流动相A:流动相B＝5:95～40:60；20～40min，流动相A:流动相B＝40:60～48:52；40～45min，流动相A:流动相B＝48:52～5:95；S4：测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，记录45min色谱图，以绿原酸为特征图谱参照物，以绿原酸色谱峰为参照物峰，测定十批明日叶药材的指纹图谱，得到由其共有特征峰构成的明日叶药材的标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有特征峰有14个，其中5号峰为绿原酸。进一步地，所述步骤S1中供试品溶液的制备包括以下步骤：称取明日叶粉末0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，加入30～60mL的75%～95%乙醇超声15～60min，过滤于5℃水浴挥干，残渣用甲醇溶解，定容到2mL的容量瓶，以离心速度13000rpm/min，离心10min，取上清液，即得供试品溶液。进一步地，所述步骤S2中对照品溶液的制备包括以下步骤：分别称取绿原酸对照品、木犀草苷对照品3mg，精密称定，分别加入甲醇溶解，定容至5mL的容量瓶，即分别得到绿原酸对照品溶液和木犀草苷对照品溶液；再分别精密吸取1300μL绿原酸对照品溶液和木犀草苷对照品溶液500μL，摇匀即得混合对照品溶液。进一步地，所述色谱柱为ULtimateXB-C8[4.6mm×250mm，5μm]色谱柱。进一步地，所述流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸。进一步地，所述柱温为25℃，流速为0.8mL/min。进一步地，所述检测波长为270nm。进一步地，所述明日叶的指纹图谱有14个共有特征峰，编号分别为1～14，以5号峰绿原酸为对照峰；各共有特征峰的相对保留时间分别为：1号峰0.210～0.212，2号峰0.225～0.226，3号峰0.415～0.421，4号峰0.889～0.894，5号峰1.000，6号峰1.137～1.139，7号峰1.200～1.202，8号峰1.221～1.223，9号峰1.308～1.325，10号峰1.478～1.492，11号峰1.507～1.521，12号峰1.536～1.552，13号峰1.558～1.574，14号峰1.660～1.680；各共有特征峰的相对峰面积的平均值分别为：1号峰0.0253，2号峰0.3310，3号峰0.6375，4号峰0.2992，5号峰1.0000，6号峰0.0680，7号峰0.0450，8号峰0.0879，9号峰0.0596，10号峰0.8045，11号峰1.0508，12号峰1.0940，13号峰0.5103，14号峰0.1018，这些共有特征峰构成了明日叶的液相指纹特征，可以作为明日叶的标准指纹图谱。进一步地，采用SPSS21.0软件对数据进行主成分分析，第一主成分主要影响明日叶样品质量的峰号为2、4、5、12、13号峰，其权重值分别为-0.942、0.950、0.928、0.998、0.985，第二成分主要影响的明日叶样品质量峰号为1、7号峰，其权重值分别为0.970和0.983。综上所述，本专利技术由于采用了上述方案，具有以下有益效果：1、本专利技术建立了不同产地的明日叶药材HPLC指纹图谱，所得指纹图谱中各特征峰分离效果较好，结合各系统适用性参数情况，并经方法学验证，该方法具有准确度高、重复性好、操作简便、稳定性好、易于掌握等优点，且分析时间较短，相似度评价有较好的一致性，主成分平面的得分图与聚类分析实验数据结果较为一致，可以较全面的反映样品的成分，能合理的评价不同产地的明日叶药材，可为全国各地明日叶的质量评价提供参考依据，为明日叶质量的规范化提供了可靠的实验依据，完善了明日叶HPLC指纹图谱的研究，保证明日叶指纹图谱的特征性和代表性。2、本专利技术提供的方法通过研究确定了最优的参数条件，采用梯度洗脱方法获得了较好的分离效果，确定14个主要特征峰为共有峰，建立了能够使多数化学成分有效分离的明日叶药材指纹图谱，所建立的标准指纹图谱有14个共有峰，信息量较大，较完整的保留了供试液中的化学成分，通过比较其共有峰可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：制备供试品溶液：称取明日叶样品制成供试品溶液，备用；/nS2：制备对照品溶液：分别称取绿原酸对照品和木犀草苷对照品，分别制成绿原酸对照品溶液、木犀草苷对照品溶液和混合对照品溶液，备用；/nS3：高效液相色谱分析：将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，在高效液相色谱检测条件下进行分析，将得到的高效液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到明日叶的指纹图谱；所述高效液相色谱检测条件如下：采用ULtimate XB-C8色谱柱；以流动相A为甲醇，流动相B为0.1～0.3%甲酸为流动相进行梯度洗脱，柱温25～35℃，流速0.8～1.2mL/min，检测波长190～400nm，分析时间35min，进样量10μL，洗脱梯度程序：0～20min时，流动相A:流动相B＝5:95～40:60；20～40min，流动相A:流动相B＝40:60～48:52；40～45min，流动相A:流动相B＝48:52～5:95；/nS4：测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，记录45min色谱图，以绿原酸为指纹图谱参照物，以绿原酸色谱峰为参照物峰，测定十批明日叶药材的指纹图谱，得到由其共有特征峰构成的明日叶药材的标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有特征峰有14个，其中5号峰为绿原酸。/n...

【技术特征摘要】
1.一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备供试品溶液：称取明日叶样品制成供试品溶液，备用；
S2：制备对照品溶液：分别称取绿原酸对照品和木犀草苷对照品，分别制成绿原酸对照品溶液、木犀草苷对照品溶液和混合对照品溶液，备用；
S3：高效液相色谱分析：将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，在高效液相色谱检测条件下进行分析，将得到的高效液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到明日叶的指纹图谱；所述高效液相色谱检测条件如下：采用ULtimateXB-C8色谱柱；以流动相A为甲醇，流动相B为0.1～0.3%甲酸为流动相进行梯度洗脱，柱温25～35℃，流速0.8～1.2mL/min，检测波长190～400nm，分析时间35min，进样量10μL，洗脱梯度程序：0～20min时，流动相A:流动相B＝5:95～40:60；20～40min，流动相A:流动相B＝40:60～48:52；40～45min，流动相A:流动相B＝48:52～5:95；
S4：测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，记录45min色谱图，以绿原酸为指纹图谱参照物，以绿原酸色谱峰为参照物峰，测定十批明日叶药材的指纹图谱，得到由其共有特征峰构成的明日叶药材的标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有特征峰有14个，其中5号峰为绿原酸。


2.根据权利要求1所述的一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤S1中供试品溶液的制备包括以下步骤：称取明日叶粉末0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，加入30～60mL的75%～95%乙醇超声15～60min，过滤于5℃水浴挥干，残渣用甲醇溶解，定容到2mL的容量瓶，以离心速度13000rpm/min，离心10min，取上清液，即得供试品溶液。


3.根据权利要求1所述的一种明日叶高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤S2中对照品溶液的制备包括以下步骤：分别称取绿原酸对照品、木犀草苷对照品3mg，精密称定，分别加入甲醇溶解，定容至5mL的容量瓶，即分别得到绿原酸对照品溶液和木犀草苷对照品溶液；再分别精密吸取1300μL绿原酸对照品溶液和木犀草苷对照品溶液500μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：丘琴，甄丹丹，符传武，丘奕定，甄汉深，梁爽，卢诗剑，
申请(专利权)人：广西中医药大学，
类型：发明
国别省市：广西;45