本发明专利技术公开了基于TaqMan‑MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒，属于病毒检测技术领域。具体包括检测虾肝肠胞虫(EHP)的引物和TaqMan‑MGB探针，以及基于上述检测引物和探针的试剂盒、检测方法。本发明专利技术设计特异性的引物及TaqMan‑MGB探针，制备了重组质粒标准品pMD18‑T‑SSU
【技术实现步骤摘要】
基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒
本专利技术涉及病毒检测
，更具体地说是涉及基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒。
技术介绍
虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)属于肠胞虫科、肠胞虫属的一种专性细胞内寄生的微孢子虫，在2004年最早发现于泰国养殖的斑节对虾并于2009年首次被分离和正式命名报道，主要感染凡纳滨对虾和斑节对虾等重要养殖虾类，是近10年危害养殖对虾的主要病原之一。EHP可通过水平和垂直传播，但主要经口摄食寄生EHP的鲜活饵料、病虾、死虾或水体中的孢子体而感染。EHP感染主要导致养殖对虾生长缓慢甚至停滞，表现为对虾消瘦、大小不均、重量离散；还可导致患病虾肝胰腺遭到破坏，免疫力降低，更容易被其他病原所侵染而死亡，给对虾养殖业造成了严重损失。研究发现，EHP感染数量与其危害密切相关，轻度感染基本上不影响对虾的生长发育，中度感染影响对虾营养吸收，严重感染损坏对虾免疫系统；但轻度感染虾会逐渐发展到重度感染。因此，建立一种快速、准确的EHP定量检测方法，在虾苗检疫、亲虾筛选及成虾养殖疫情监测中可根据EHP定量数据结合虾的大小和养殖模式制定相应的措施，对防控由EHP引起的虾病害具有重要的意义。EHP感染前期无明显病症，需采用组织学方法或分子生物学方法等实验室手段检测才能确诊。EHP检测方法包括原位杂交、套式PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增(LAMP)等，但是这些方法在灵敏度和便捷程度上各有优缺点；特别是在EHP定量检测方面，目前采用的TaqMan探针定量PCR由于探针长度太长，敏感性不够理想。目前国内尚未发布EHP检测的相关标准，而农业农村部在虾肝肠胞虫病(EHPD)监测计划中仍推荐采用套式PCR法进行检测。但在实际检测工作中，套式PCR法存在操作繁琐、检测时间长、不能定量等缺点，不能满足对EHP进行快速定量检测的需求。因此，建立一种基于TaqMan-MGB探针的EHP荧光定量PCR检测方法，以提高EHP定量检测的灵敏度及效率是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒。荧光定量PCR相比普通PCR，其检测和分析过程在密闭的单管里由机器自动完成，具自动化程度高、有效解决PCR产物污染问题、能定量检测病原体感染的强弱等优点，在实验室检测病原体的方法选择上被认为是最理想的方法；TaqMan-MGB探针则是荧光定量PCR使用的一种荧光探针，其3′端的淬灭基团为不发光的MGB(MinorGrooveBinder)结合物，可实现高Tm值的探针长度缩短易于与模板退火而利于提高方法的灵敏度，且探针3′端不发光的淬灭基团与5′端报告基团在空间的位置更接近，使荧光本底降低、实验结果分辨率更高。本专利技术的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法既能发挥荧光定量PCR法的优势而克服套式PCR法的缺点，且其探针连接MGB基团相对于TaqMan探针因长度缩短易于与模板退火而更有利于提高方法的灵敏度，非常适用于对灵敏度要求高的病原体定量检测，可提高EHP检测的敏感性和效率。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组，包括上游引物EHP-qF66、下游引物EHP-qR66和TaqMan-MGB探针EHP-qP66，序列如下：EHP-qF66：5’-CGCGGTAATTCCAACTCCAA-3’，SEQIDNo.1；EHP-qR66：5’-TCTACGACTACGGACCCTTTAACTG-3’，SEQIDNo.2；EHP-qP66：5’-FAM-AGTGTCTATGGTGGATGCT-MGB-3’，SEQIDNo.3；其中，EHP-qP66的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。根据寄生虫的核糖体小亚基(SSUrDNA)基因序列保守性高的特点及TaqMan-MGB探针的优势，在EHP的SSUrDNA基因(KF362129)保守区域设计了特异性的引物及TaqMan-MGB探针；TaqMan-MGB探针是在TaqMan探针的3′端连上不发光的淬灭基团MGB(MinorGrooveBinder)结合物，与TaqMan探针相比具有探针长度短、稳定性好、分辨率高等特点。本专利技术还提供了一种基于上述引物组的检测试剂盒，包括反应液、工作标准品、阳性对照和阴性对照。优选的：反应液包括2×ProbeqPCRPremixExTaqTM、ROXReferenceDyeⅡ、上游引物EHP-qF66和下游引物EHP-qR66、TaqMan-MGB探针EHP-qP66和灭菌ddH2O。优选的：每剂反应液为45μL，包含2×ProbeqPCRPremixExTaqTM25μL，ROXReferenceDyeⅡ0.5μL，10μmol/L上下游引物EHP-qF66和EHP-qR66各3.0μL，10μmol/LTaqMan-MGB探针EHP-qP663.0μL，灭菌ddH2O10.5μL。优选的：工作标准品为pMD18-T-SSUEHP，浓度为1.0×104～1.0×108拷贝/μL，各200μL。优选的：工作标准品pMD18-T-SSUEHP的制备方法为：PCR扩增EHPDNA，经琼脂糖凝胶回收纯化后与pMD18-T连接，转化DH5α，得到重组质粒pMD18-T-SSUEHP，并进行PCR及测序鉴定。优选的：阳性对照为1.0×105拷贝/μL的pMD18-T-SSUEHP，所述阴性对照为不含EHPDNA的虾组织DNA溶液，各200μL。重组质粒pMD18-T-SSUEHP稳定性好，可满足作为工作标准品和阳性对照的要求。本专利技术还提供了上述引物组在制备检测虾肝肠胞虫的试剂盒中的应用，采用50μL反应体系，即45μL反应液加入5μL待检模板；待检样品与工作标准品、阳性对照、阴性对照、空白对照同时进行检测；荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸35s，扩增40个循环；在60℃结束时收集荧光信号；质量控制：建立标准曲线，其相关系数方值RSq应≥0.980；阴性对照和空白对照的Ct值应不显示，阳性对照的EHPDNA拷贝量应为1×104～1×106拷贝/μL，否则检测视为无效。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒，取得的技术效果为基于EHP定量检测的需求及TaqMan-MGB探针应用于病原体检测的优势，在EHP的SSUrDNA基因保守序列设计了特异性的引物及TaqMan-MGB探针，制备了重组质粒标准品pMD18-T-SSUEHP；通过对反应体系优化，确定了检测EHP的荧光定量PCR的最佳条件；重组本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组，其特征在于，包括上游引物EHP-qF66、下游引物EHP-qR66和TaqMan-MGB探针EHP-qP66，序列如下：/nEHP-qF66：5’-CGCGGTAATTCCAACTCCAA-3’，SEQ ID No.1；/nEHP-qR66：5’-TCTACGACTACGGACCCTTTAACTG-3’，SEQ ID No.2；/nEHP-qP66：5’-FAM-AGTGTCTATGGTGGATGCT-MGB-3’，SEQ ID No.3；/n其中，EHP-qP66的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。/n
【技术特征摘要】
1.一种基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组，其特征在于，包括上游引物EHP-qF66、下游引物EHP-qR66和TaqMan-MGB探针EHP-qP66，序列如下：
EHP-qF66：5’-CGCGGTAATTCCAACTCCAA-3’，SEQIDNo.1；
EHP-qR66：5’-TCTACGACTACGGACCCTTTAACTG-3’，SEQIDNo.2；
EHP-qP66：5’-FAM-AGTGTCTATGGTGGATGCT-MGB-3’，SEQIDNo.3；
其中，EHP-qP66的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。
2.一种基于权利要求1所述引物组的检测试剂盒，其特征在于，包括反应液、工作标准品、阳性对照和阴性对照。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反应液包括2×ProbeqPCRPremixExTaqTM、ROXReferenceDyeⅡ、上游引物EHP-qF66和下游引物EHP-qR66、TaqMan-MGB探针EHP-qP66和灭菌ddH2O。
4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反应液共2.3mL；每剂反应液为45μL，包含2×ProbeqPCRPremixExTaqTM25μL，ROXReferenceDyeⅡ0.5μL，10μmol/L上下游引物EHP-qF66和EHP-qR66各3.0...
【专利技术属性】
技术研发人员：童桂香，韦信贤，林勇，谭红连，陈秀荔，熊建华，黄光华，杨慧赞，王瑞，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：广西;45
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。