人星形胶质细胞重编程为神经元或类脑器官的组合物与方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种人星形胶质细胞重编程为神经元或类脑器官的组合物与方法。高效地将人星形胶质细胞重编程为神经元的组合物包括能够实现OCT4过表达的物质，敲低细胞周期调节因子p53的物质，以及能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的小分子药物，所述能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的小分子药物选自以下四个小分子药物中的一种或几种：CHIR99021、SB431542、RepSox或Y27632。与现有技术相比，本发明专利技术结合两个基因的调控，同过大量筛选得到能高效重编程人星形胶质细胞为神经元和类脑器官的全新的小分子药物组合，并在人胚胎干细胞H9分化而来的星形胶质细胞和胶质瘤病人瘤旁组织的星形胶质细胞上验证了筛选得到的系统可靠性。

【技术实现步骤摘要】
人星形胶质细胞重编程为神经元或类脑器官的组合物与方法
本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种人星形胶质细胞重编程为神经元或类脑器官的组合物与方法。
技术介绍
2017年，StemCellReports在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所裴钢研究组的研究论文“DirectGenerationofHumanNeuronalCellsfromAdultAstrocytesbySmallMolecules”，报道了利用小分子化合物组合实现将成人星形胶质细胞直接转变为神经细胞的研究成果。裴钢院士课题组利用6个小分子药物把人星形胶质细胞重编程为功能性神经元，图1为技术方案图。具体方案是：将人成体星形胶质细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的星形胶质细胞生长培养基(AM)中。两天后细胞达到90％的密度，生长培养基更换为Neurobasal+1％B27+1％N2+BDNF(20ng/ml)+GDNF(20ng/ml)+IGF(20ng/ml)+Vc(0.2μM)+dibutyryl-cAMP(100μM)+laminin(1μg/ml)(称为NM培养基)。在此基础上，加入六个小分子药物0.5mMVPA(Calbiochem)、3μMChir99021(Selleck)、1μMRepsox(Biovision)、10μMForskolin(Cayman)、2μMi-BET151(MedChemExpress)、10μMISX-9(MedChemExpress)进行神经元的诱导。含小分子药物的诱导培养基每4天更换一次，加药诱导时间为20天，在此过程中，必要时加入人星形胶质细胞以支持神经元成熟。这一诱导方法在第12天时就可以检测到MAP2和NEUN阳性的神经元。相比较起始细胞总量，诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的效率为8％。这一诱导过程中并没有细胞增殖。中国专利CN111073855A公开了诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用，专利技术揭示了利用不同转录因子组合在体外诱导星形胶质细胞直接重编程产生有功能的五羟色胺能神经元的方法，将得到的这些神经元移植到脑内能够存活。在应用转录因子的基础上加入化学小分子可以进一步提高产生五羟色胺能神经元的效率和成熟程度。利用该专利技术的方法产生的五羟色胺能神经元，可以用于神经再生，以及多种神经系统疾病的模拟和药物筛选。尽管如上所述裴钢课题组的技术还是中国专利CN111073855A公开的技术可以重编程人星形胶质细胞为神经元，但是这种重编程方法对于中枢神经组织再生的应用上仍存在一些缺陷，比如：(1)星形胶质细胞被直接重编程为有丝分裂后神经元无法进行大量增殖，因此也就无法获得大量目的神经细胞；(2)这种重编程的细胞不具有自我组装形成人脑组织的能力，如类脑器官等；(3)这种重编程方法是2D系统，不具有3D脑组织结构和功能连接。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种人星形胶质细胞重编程为神经元或类脑器官的组合物与方法。本申请的专利技术人通过大量的试验验证与机理研究发现，如上所述现有技术中存在的缺点是由于以下原因造成的：1、某些信号通路或表观遗传修饰，只能重编程星形胶质细胞产生特定的神经元亚型，可塑性差。2、重编程得到的神经元多为有丝分裂后期神经元，属于终末分化的神经元不具有增殖能力；不经过具有增殖能力的神经前体阶段；由此也就无法获得大量的目的细胞。3、诱导系统为2D培养系统无法形成3D脑组织结构。本申请的专利技术人研究发现，以上缺点可以通过调控干性相关基因的表达以及激活特异信号通路来诱导大量增殖的神经前体阶段，并结合3D诱导培养技术来实现类脑器官的构建来补救。因此，本专利技术通过大量筛选发现了一对基因和四个小分子药物的组合可以高效地重编程人星形胶质细胞为神经元。结合3D诱导培养技术，被重编程的星形胶质细胞能够培养成3D类脑器官。通过调控脊髓发育诱导信号分子，重编程的星形胶质细胞可以被诱导成脊髓的类器官，这类类器官未来有望用于脊髓损伤、脑缺血损伤等神经组织修复的细胞治疗中。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术第一方面，提供可以高效地将人星形胶质细胞重编程为神经元的组合物：所述组合物包括能够实现OCT4过表达的物质和敲低细胞周期调节因子p53的物质。实现OCT4过表达的物质采用本领域常用的实现OCT4过表达的物质即可。敲低细胞周期调节因子p53的物质采用本领域通常使用的用于敲低细胞周期调节因子p53的物质即可。在本专利技术第一方面的一个实施方式中，提供同时OCT4过表达和p53敲低的物质，选择载体pCXLE-hOCT3/4-shp53-F，Addgene编号#27077。pCXLE-hOCT3/4-shp53-F，Addgene编号#27077为已知的现有技术。本专利技术第二方面，提供能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的组合物，所述组合物选自以下四个小分子药物中的一种或几种：CHIR99021、SB431542、RepSox或Y27632。在本专利技术第二方面的一个实施方式中，优选地，CHIR99021的用量为1.5μM，SB431542的用量为5μM，RepSox的用量为1μM，Y27632的用量为10μM。在本专利技术第二方面的一个实施方式中，所述能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的组合物为CHIR99021、SB431542、RepSox与Y27632的组合。在本专利技术第二方面的一个实施方式中，优选地，CHIR99021、SB431542、RepSox与Y27632的组合使用时，CHIR99021的用量为1.5μM，SB431542的用量为5μM，RepSox的用量为1μM，Y27632的用量为10μM。本专利技术第三方面，提供可以高效地将人星形胶质细胞重编程为神经元的组合物：所述组合物包括能够实现OCT4过表达的物质，敲低细胞周期调节因子p53的物质，以及能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的小分子药物，所述能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的小分子药物选自以下四个小分子药物中的一种或几种：CHIR99021、SB431542、RepSox或Y27632。在本专利技术第三方面的一个实施方式中，优选地，提供同时OCT4过表达和p53敲低的物质，选择载体pCXLE-hOCT3/4-shp53-F，Addgene编号#27077。在本专利技术第三方面的一个实施方式中，优选地，CHIR99021的用量为1.5μM，SB431542的用量为5μM，RepSox的用量为1μM，Y27632的用量为10μM。在本专利技术第三方面的一个实施方式中，所述能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的小分子药物为CHIR99021、SB431542、RepSox与Y27632的组合。在本专利技术第三方面的一个实施方式中，优选地，CHIR99021、SB431542、RepSox与Y27632的组合使用时，CHIR99021的用量为1.5μM，SB431542本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可以高效地将人星形胶质细胞重编程为神经元的组合物，其特征在于，所述组合物包括能够实现OCT4过表达的物质和敲低细胞周期调节因子p53的物质。/n

【技术特征摘要】
1.一种可以高效地将人星形胶质细胞重编程为神经元的组合物，其特征在于，所述组合物包括能够实现OCT4过表达的物质和敲低细胞周期调节因子p53的物质。


2.能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的组合物，其特征在于，所述组合物选自以下四个小分子药物中的一种或几种：CHIR99021、SB431542、RepSox或Y27632。


3.高效地将人星形胶质细胞重编程为神经元的组合物：其特征在于，所述组合物包括能够实现OCT4过表达的物质，敲低细胞周期调节因子p53的物质，以及能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的小分子药物，所述能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的小分子药物选自以下四个小分子药物中的一种或几种：CHIR99021、SB431542、RepSox或Y27632。


4.根据权利要求2或3所述组合物，其特征在于，CHIR99021的用量为1.5μM，SB431542的用量为5μM，RepSox的用量为1μM，Y27632的用量为10μM。


5.根据权利要求2或3所述组合物，其特征在于，所述能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的组合物为CHIR99021、SB431542、RepSox与Y27632的组合。


6.将人星形胶质细胞重编程为神经元的方法，其特征在于，包括如下步骤：
用AM培养基培养人星形胶质细胞至80-90％的密度；
人星形胶质细胞中加入能够实现OCT4过表达的物质，以及敲低细胞周期调节因子p53的物质，实现OCT4过表达和p53敲低；
用AM培养基培养2天，到第三天开始加入能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的小分子药物进行诱导，能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的小分子药物选自以下四个小分子药物中的一种或几种：CHIR99021、SB431542、RepSox或Y27632；
从加入能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的小分子药物开始，培养基换为神经元培养基，2或3天更换培养基，第8天，不再向神经元培养基中加入能够诱导人星形胶质细胞重编程为神经元的小分子药物，保持2-3天更换新鲜的神经元培养基继续培养至21天。


7.人星形胶质细胞诱...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵志成，方诗，许锦洪，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31