用于治疗皮肤损伤的细菌分泌物组制造技术

本发明专利技术涉及细菌分泌物组在治疗皮肤损伤尤其是伤口愈合中的新用途。本发明专利技术还涉及包含这种细菌分泌物组作为活性剂的美容或皮肤病学组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗皮肤损伤的细菌分泌物组
本专利技术涉及细菌分泌物组在治疗皮肤损伤尤其是伤口愈合领域中的新用途。本专利技术还涉及包含这种细菌分泌物组作为活性剂的美容或皮肤病学组合物。
技术介绍
伤口愈合是一个复杂而动态的生物学过程，包括正常组织修复中许多局部和全身因子的相互作用。在三个相互依赖的阶段进行愈合：止血和炎症、增殖和重塑(Generalprinciplesofwoundhealing.WitteMB,BarbulA.SurgClinNorthAm.1997June；77(3):509–28)。增殖包括三个可明显观察到的过程：制粒、收缩和再上皮形成。在制粒过程中，观察到参与修复过程的细胞增殖并向伤口床迁移。例如，在那里发现了巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞。巨噬细胞稳定释放趋化因子和生长因子。成纤维细胞构建了细胞在伤口基底上生长所必需的新细胞基质。该支架支持细胞迁移。最后，内皮细胞触发血管芽的形成，这将建立新的毛细血管，从而恢复灌注并确保提供氧气和伤口中细胞代谢活性所必需的营养。伤口收缩是减小伤口大小的机制，成纤维细胞在该收缩中起主导作用。再上皮形成包括覆盖伤口的表皮再生，以形成对外部环境有效的屏障，能够使皮肤着色，并恢复其感觉和免疫功能。因此，其包括角质形成细胞迁移和增殖的细胞过程，还包括这种新上皮细胞的分化以及修复连接真皮和表皮的基底膜。当基底细胞向伤口中心的迁移使两个伤口边缘相遇时，发生一波细胞有丝分裂，以填充迁移留下的空间，并为三维再生中的上皮组织提供细胞。角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞的增殖阶段可以被认为是显示活性剂愈合活性的功能现象之一。成纤维细胞增殖的增加将参与深部伤口(到达真皮)的愈合，而角质形成细胞增殖的增加将参与再上皮形成。当愈合缺陷或愈合不良导致难看的且通常是永久性可见标记，如厚疤痕或瘢痕疙瘩时，愈合也会带来美容问题。所有的美容和皮肤病手术程序以及病理性和非医疗的创伤性损伤(刮伤、割伤、擦伤、烧伤)都会留下疤痕。整形外科医生的主要技能之一是控制疤痕的形成。例如，压力已多年被用于烧伤疤痕，最近已与铺在疤痕上的硅薄膜直接联合。仍然需要提出新的组合物，以促进受损皮肤的愈合并改善疤痕的外观。
技术实现思路
令人惊讶的是，本申请人首次表明从地下水分离出的细菌菌株(或细菌)LMB64衍生的细菌分泌物组在组织再生和皮肤损伤愈合中的有益特性。该细菌在专利申请WO2012/085182中由申请人描述。更具体地，描述了该细菌的抗炎活性。甚至更具体地，描述并例举了名为S0、E0和ES0的提取物，所述提取物分别由从生物质分离的培养上清液、裂解细胞的生物质以及在碱性pH下培养物孵育数小时后的上清液组成。仅测试了提取物E0和ES0的药理活性，表明这些提取物E0和ES0能够诱导细胞因子和朗格汉斯细胞的成熟(对于E0)，以及激活TLR2/TLR4/TLR5、拮抗PAR和诱导抗微生物肽(对于ES0)。这些结果表明这些提取物用于治疗炎性疾病，例如瘙痒症、牛皮癣、湿疹或特应性皮炎的用途。出乎所有人的意料，申请人在本文中表明，与上述提取物ES0和E0组成不同、但主要由所述细菌LMB64分泌和外在化到培养上清液的生物分子组成的分泌物组具有令人惊讶的愈合特性。详细说明根据第一个实施方案(1)，本专利技术涉及用于治疗皮肤损伤的属于β-变形杆菌(Betaproteobacteria)纲、奈瑟菌(Neisseriaceae)亚科的非致病性革兰氏阴性细菌的细菌分泌物组，所述细菌包含具有序列SEQIDNo.1或与序列SEQIDNo.1具有至少80％同一性的任何序列的16SARNr，所述分泌物组可能通过或通过包括以下步骤的方法获得：–a)在培养基和适合其生长的条件下培养所述细菌，–b)液/固分离和回收液相，–c)获得所述分泌物组，其包含所述细菌在液相中分泌的生物分子。根据本专利技术的第二个实施方案，根据本专利技术的用于治疗皮肤损伤的细菌分泌物组的特征在于，将碱性缓冲液添加到步骤b)中获得的液相中，任选地使获得的缓冲液相保持接触1至7小时，优选在1至6℃的温度。细菌LMB64已被表征和定义为属于β-变形杆菌纲、奈瑟菌亚科，其可能是尚未定义的新属。对编码16S核糖体ARN(ARNr)的基因序列进行分析后，有可能将该细菌分类为接近色杆菌属(Chromobacterium)、Paludimonas、Lutelia和Glubenkiana属，与其共享95％的序列相似性。这种非致病性细菌是革兰氏阴性细菌，是从地下水中分离的。更具体地，细菌LMB64是棒状的，长度约为2.3μm(±0.3)、宽度约为1.0μm(±0.1)。该细菌的特征是极鞭毛的存在。编码16SARNr的基因几乎已完全测序(1487bp，对应于序列SEQIDNo.1)。细菌LMB64具有10948bp的环状质粒。该质粒已完全测序，其序列表示为SEQIDNo.2。根据另一个实施方案，衍生本专利技术的分泌物组的细菌包含至少一个质粒，该质粒包含序列SEQIDNo.2，或与序列SEQIDNo.2具有至少80％同一性的任何序列，有利地与序列SEQIDNo.2具有至少85％、至少90％、至少95％、甚至至少97％并且更优选至少98％的同一性。另外，衍生分泌物组的细菌是属于β-变形杆菌纲、奈瑟菌亚科的非致病性革兰氏阴性细菌，所述细菌含有16SARNr，所述16SARNr包含序列SEQIDNo.1或与序列SEQIDNo.1具有至少80％、甚至至少90％、至少95％、至少97％同一性的任何序列，并且所述细菌包含至少一个质粒，所述质粒包含序列SEQIDNo.2或与序列SEQIDNo.2具有至少80％同一性、有利地与序列SEQIDNo.2具有至少85％、至少90％、至少95％、甚至至少97％、更优选至少98％同一性的任何序列。举例来说，这种细菌以菌株LMB64表示，该菌株以申请人的名义于2010年4月8日保藏在巴黎巴斯德研究所国家微生物保藏中心(CNCM)，保藏号I-4290。有了这种基因型信息，再加上有关无硫培养基中生长的特征和该细菌的非丝状性质，本领域技术人员将不难发现/鉴定另一种能够获得本专利技术的分泌物组的细菌。可以在选择研究后鉴定这样的另一种细菌，当然其在基因型上稍有不同，但是就分泌物组而言具有本专利技术的所有表型标准，这决不是不可实现的，而且这是基于本申请中包含的以及在申请WO2012/085182中包含的信息，结合本领域技术人员的常识。在本专利技术的上下文中，两个核酸序列之间的“同一性百分比”是指在最好比对(最佳比对)后获得的两个待比较序列之间的相同核苷酸的百分比，该百分比纯粹是统计学上的，并且这两个序列之间的差异随机分布并在整个长度上。两个核酸序列之间的序列比较通常在以最佳方式比对它们之后，通过比较这些序列来进行，其中所述比较可以按区段或按“比较窗”进行。除手动外，还可以借助Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2:48本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗皮肤损伤的属于β-变形杆菌纲奈瑟菌亚科的非致病性革兰氏阴性细菌的细菌分泌物组，其包含16S ARNr，所述16S ARNr具有序列SEQ ID No.1或与序列SEQ IDNo.1具有至少80％同一性的任何序列，/n所述分泌物组通过包括以下步骤的方法获得：/n–a)在培养基和适合其生长的条件下培养所述细菌，/n–b)液/固分离和回收液相，/n–c)获得所述分泌物组，其包含所述细菌在液相中分泌的生物分子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170406 FR 17530121.一种用于治疗皮肤损伤的属于β-变形杆菌纲奈瑟菌亚科的非致病性革兰氏阴性细菌的细菌分泌物组，其包含16SARNr，所述16SARNr具有序列SEQIDNo.1或与序列SEQIDNo.1具有至少80％同一性的任何序列，
所述分泌物组通过包括以下步骤的方法获得：
–a)在培养基和适合其生长的条件下培养所述细菌，
–b)液/固分离和回收液相，
–c)获得所述分泌物组，其包含所述细菌在液相中分泌的生物分子。


2.根据权利要求1所述的用于治疗皮肤损伤的细菌分泌物组，其特征在于，将碱性缓冲液添加到步骤b)中获得的液相中，任选地使获得的缓冲液相保持接触1至7小时，优选在1至6℃的温度下。


3.根据权利要求2所述的用于治疗皮肤损伤的细菌分泌物组，其特征在于，所述碱性缓冲液选自Tris缓冲液、精氨酸缓冲液及其混合物。


4.根据权利要求1至3之一所述的用于治疗皮肤损伤的细菌分泌物组，其特征在于，在液/固分离的步骤b)之后、在步骤c)之前是通过过滤来澄清液相或澄清缓冲液相的步骤b')。


5.根据权利要求4所述的用于治疗皮肤损伤的细菌分泌物组，其特征在于，以0.2μm截留值进行过滤。


6.根据权利要求1至5之一所述的用于治疗皮肤损伤的细菌分泌物组，其特征在于，所述生物分子由所述细菌分泌的肽、蛋白质和次级代谢物组成。

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【专利技术属性】
技术研发人员：N·卡斯泰里齐，M·F·加利亚诺，H·赫尔南德斯皮金，
申请(专利权)人：皮埃尔·法布尔皮肤化妆品公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR