一种DNA阻断序列组合物及其制备方法和检测系统及检测方法技术方案

本发明专利技术公开一种DNA阻断序列组合物及其制备方法和检测系统及检测方法，属于生物技术领域。阻断序列组合物包括阻断序列A和阻断序列B，阻断序列A和阻断序列B可分别与目标DNA序列的正义链和反义链结合。两种阻断DNA序列均包括，单链toehold序列部分、双链主反应部分和发卡序列。本发明专利技术设计简单，仅根据目标位点所在序列的野生型序列信息进行设计，无需预先知道变异位点的具体位置和类型。且，独立性好，相互之间无相互作用发生，不会产生其他副产物。该阻断序列基于DNA链置换的反应原理，可特异性阻断目标序列的扩增。且对PCR退火温度要求不高，均有利于推广用于多重目标片段的Block PCR反应。本发明专利技术的封闭效果特异性好，可结合测序实现样本中0.1％SNP的富集检出。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA阻断序列组合物及其制备方法和检测系统及检测方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种DNA阻断序列组合物及其制备方法，和检测系统、检测方法。
技术介绍
在目前的分子诊断中，DNA序列变异是一种非常有价值的分子标志物。可应用领域主要包括液体活检、产前诊断、感染性疾病、器官移植以及法医学。统计结果显示，截止到2018年，全球估计有1819万癌症新增病例以及960万癌症死亡病例。我国癌症患病率在国际上位于中等偏上水平，每天约有1万人确诊癌症，相当于平均每分钟就有7个人得癌症。现有研究表明，携带疾病信息的单碱基变异，尤其是低频突变位点的检测在癌症液体活检中是有重要意义的。例如，循环肿瘤DNA稀有突变位点的检测有助于癌症的早期检测、药物抗性的动态监测、发现微小残留病灶等。ddPCR和ARMS技术因其检测灵敏度高，已广泛用在已知变异位点检测中，然而这两种方法都需要针对特定已知类型的位点进行设计，应用通量低，不适用于未知位点的检测和复杂多样的临床应用。Sanger测序因其准确、稳定，价格低廉的特征，目前仍广泛应用，然而，这种方法只能用于检测SNP比例大于20％的样本。高通量二代测序技术(Next-generationsequence，NGS)已广泛应用于DNA序列分析中。在NGS相关应用研究中，为了减少测序成本，通常在测序文库构建过程中结合多重PCR和DNA杂交的方法进行靶向富集。在对目标片段进行富集过程中，携带突变位点的DNA序列和正常野生型DNA序列会统一被富集到测序文库中，携带变异位点的DNA序列仍然会淹没在正常野生型DNA序列的海洋中。在现在的标准操作流程下，二代测序技术尚不能精准识别低于2％的DNA单碱基变异，基于NGS的DNA低频突变位点的准确、灵敏地检测仍然存在很大的挑战性。尽管DNA序列精确度可以通过分子条形码和高深度测序实现，但是这些方法都需要对每个DNA分子进行大量读出，野生型序列消耗了大量的试剂和序列读出能力，造成数据量大，分析困难，超深度测序可以提供更多有意义的DNA稀有变异的序列信息，然而这种方法的高额费用，阻碍了广泛临床应用。随着高通量测序技术的发展和广泛应用，迫切需要研究用于移除高丰度野生型DNA序列的方法，用于测序之前，对未知位点和类型的突变DNA序列(尤其是低频突变位点)进行负向富集。此类方法，通常通过对野生型序列进行选择性封闭，实现对未知突变位点序列的选择性扩增。现有已报道的DNA封闭探针包括普通DNA序列、PNA、LNA。这些特异性封闭方法的实现依赖于封闭探针与正常序列和野生型序列形成双链结构的差异性Tm值，因此对每个反应的温度控制要求非常严格。Tm值依赖的PCR反应，仅仅适用于同时富集单个或者限制数量的目标分子。对探针合成技术要求高，限制了在高通量测序技术应用过程中的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术实施例提供了一种DNA阻断序列组合物及其制备方法，检测系统及检测方法，结合sanger测序，实现了对样本中低达0.1％的变异基因序列的检出。为了对披露的实施例的一些方面有一个基本的理解，下面给出了简单的概括。该概括部分不是泛泛评述，也不是要确定关键/重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围。其唯一目的是用简单的形式呈现一些概念，以此作为后面的详细说明的序言。根据本专利技术实施例的第一方面，提供了一种DNA阻断序列组合物，包括，阻断序列A和阻断序列B；其中，所述阻断序列A可与目标DNA序列的正义链结合，所述阻断序列B可与目标DNA序列的反义链结合；且，所述阻断序列A和所述阻断序列B均包括：(1)单链toehold序列部分：阻断序列的缺口区域，可以识别目标DNA，能与目标DNA序列互补，引发链置换反应；且，所述阻断序列A和所述阻断序列B的toehold位置不同；(2)双链主反应部分(自配对)：所述阻断序列A的主反应部分用于与所述正义链互补配对，所述阻断序列B的主反应部分用于与所述反义链互补配对；(3)发卡序列：5′-T……T-3′，其中，“T……T”中碱基T的数量为6-10。可选地，所述单链toehold序列部分中的toehold序列包括4-10个碱基。可选地，所述双链主反应部分的DNA刚性段为15-30个碱基对。可选地，所述阻断序列A和阻断序列B的摩尔比为1﹕1。可选地，还包括，缓冲液，所述阻断序列A和阻断序列B混合，得到混合液形式的DNA阻断序列组合物。可选地，所述混合液形式的DNA阻断序列组合物中，阻断序列A和阻断序列B的总浓度为4-10μmol/L。根据本专利技术实施例的第二方面，提供一种DNA阻断序列组合物的制备方法，包括以下步骤：分别合成阻断序列单链A和阻断序列单链B；并分别将所述阻断序列单链A和所述阻断序列单链B溶解，得，A溶液和B溶液；将所述A溶液和所述B溶液分别与退火缓冲液混合，得A退火溶液和B退火溶液；将所述A退火溶液和所述B退火溶液分别进行退火处理，获得阻断序列A和阻断序列B。可选地，所述制备方法，还包括，将所述阻断序列A和所述阻断序列B混合，然后稀释，得到DNA阻断序列组合物。根据本专利技术实施例的第三方面，提供一种检测系统，包括前述的DNA阻断序列组合物和PCR扩增试剂(阻断PCR扩增试剂)；其中，所述PCR扩增试剂中采用无5’外切酶活性的DNA聚合酶。可选地，检测系统，还包括第二PCR扩增试剂，第二PCR扩增试剂用于微量目标DNA序列或携带有目标DNA序列的gDNA的扩增反应。根据本专利技术实施例的第四方面，提供一种检测方法，包括以下步骤：将微量目标DNA序列或携带有目标DNA序列的gDNA进行PCR预扩增反应，得到目标DNA序列的预扩增产物；向所述目标DNA序列的预扩增产物中加入DNA阻断序列组合物，得混合溶液；对所述混合溶液进行目标序列阻断PCR扩增，得目标序列阻断的PCR扩增产物；对所述目标序列阻断的PCR扩增产物进行磁珠纯化，得纯化DNA产物；对所述纯化DNA产物进行凝胶电泳表征；对所述纯化DNA产物进行序列检测。可选地，所述混合溶液中，DNA阻断序列组合物中的阻断序列A和阻断序列B的总浓度为0.1-1μmol/L。可选地，所述混合溶液中，DNA阻断序列组合物中的阻断序列A和阻断序列B的总浓度为1μmol/L。可选地，所述阻断PCR扩增反应中，退火温度为55℃-65℃。可选地，所述阻断PCR扩增反应中，退火温度为60℃。可选地，所述阻断PCR扩增反应中，退火时间为30s-5min。可选地，所述阻断PCR扩增反应中，退火时间为30s。可选地，所述磁珠纯化中，以阻断PCR扩增产物和磁珠的体积比为1﹕1进行。本专利技术实施例的检测方法中，序列检测可以采用Sanger测序法、qPCR定量、ddPCR定量等方法进行检测。本专利技术实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：1.本专利技术设计简单，仅根据目标位点所在序列的野生型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA阻断序列组合物，其特征在于，包括，阻断序列A和阻断序列B；其中，所述阻断序列A可与目标DNA序列的正义链结合，所述阻断序列B可与目标DNA序列的反义链结合；且，所述阻断序列A和所述阻断序列B均包括，/n(1)单链toehold序列部分：阻断序列的缺口区域，可以识别目标DNA，能与目标DNA序列互补，引发链置换反应；且，所述阻断序列A和所述阻断序列B的toehold位置不同；/n(2)双链主反应部分：所述阻断序列A的主反应部分用于与所述正义链互补配对，所述阻断序列B的主反应部分用于与所述反义链互补配对；/n(3)发卡序列：5′-T……T-3′，其中，“T……T”中碱基T的数量为6-10。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA阻断序列组合物，其特征在于，包括，阻断序列A和阻断序列B；其中，所述阻断序列A可与目标DNA序列的正义链结合，所述阻断序列B可与目标DNA序列的反义链结合；且，所述阻断序列A和所述阻断序列B均包括，
(1)单链toehold序列部分：阻断序列的缺口区域，可以识别目标DNA，能与目标DNA序列互补，引发链置换反应；且，所述阻断序列A和所述阻断序列B的toehold位置不同；
(2)双链主反应部分：所述阻断序列A的主反应部分用于与所述正义链互补配对，所述阻断序列B的主反应部分用于与所述反义链互补配对；
(3)发卡序列：5′-T……T-3′，其中，“T……T”中碱基T的数量为6-10。


2.根据权利要求1所述的一种DNA阻断序列组合物，其特征在于，所述单链toehold序列部分中的toehold序列包括4-10个碱基。


3.根据权利要求1所述的一种DNA阻断序列组合物，其特征在于，所述双链主反应部分的DNA刚性段为15-30个碱基对。


4.根据权利要求1所述的一种DNA阻断序列组合物，其特征在于，所述阻断序列A和阻断序列B的摩尔比为1﹕1。


5.根据权利要求1所述的一种DNA阻断序列组合物，其特征在于，还包括，缓冲液，所述阻断序列A和阻断序列B与所述缓冲液混合，得到混合液形式的DNA阻断序列组合物。


6.如权利要求1至5中任一项所述的DNA阻断序列组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖荣荣，
申请(专利权)人：北京大橡科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11