一种完全型先天性静止性夜盲果蝇模型的构建方法及应用技术

一种完全型先天性静止性夜盲果蝇模型的构建方法及应用，通过构建具有模拟CSNB的果蝇模型，用于研究该病的病理进程和机制，也可用于大规模筛选延缓或治疗该疾病的药物，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种完全型先天性静止性夜盲果蝇模型的构建方法及应用
本专利技术属于分子生物学和基因工程
，具体涉及一种完全型先天性静止性夜盲果蝇模型的构建方法及应用。
技术介绍
先天性静止性夜盲（CSNB）是一类具有遗传异质性的非进行性视网膜遗传病，主要以视杆细胞功能异常为特征，临床表现为夜盲，视力下降，眼球震颤，近视和斜视等。根据ERG的不同分为两种：Schubert-Bornschein型表现为b波比a波低，伴视敏度下降、近视和眼震；而Riggs型表现为a波和b波等比例降低，视敏度正常，不伴近视和眼震。其中Schubert-Bornschein型又可分为完全型和不完全型：完全型又称为1型，视杆细胞通路功能完全尚失；不完全型又称2型，视杆和视锥细胞通路功能同时受损，视杆功能受损程度较1型轻，但临床症状较1型重。至今为止，研究发现能引起视网膜疾病的基因突变超过300个，其中7个基因突变能引起Schubert-Bornschein型CSNB，分别为CABP4(MIM608965)，GPR179(MIM614515)，GRM6(MIM604096)，LRIT3(MIM615004)，TRPM1(MIM603576)，CACNA1F(MIM300110)和NYX(MIM300278)。GRM6也称作谷氨酸受体代谢型6，其在视网膜中以一种双极性细胞的亚型特异性表达，这种亚型细胞对光响应而去极化，称为ON双极性细胞。这些细胞与感光细胞形成突触，并通过GPCR信号转导级联检测神经递质谷氨酸。谷氨酸受体GRM6突触后位于双极细胞树突的尖端，并负责启动最终控制TRPM1通道门控的信号级联反应。人类疾病的动物模型早已应用于医疗，制药等领域，并日渐展现出不可被替代的优势。黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)是生物学研究中最重要的模式昆虫之一,它在遗传的染色体理论建立、神经科学、发育生物学、人类疾病研究等领域得到广泛应用，作出许多重要贡献。果蝇和人类基因组序列同源性高达60%，而且人体75%的已知致病基因与果蝇身上的相似，因此染色体相对简单的果蝇非常适合人类遗传学或疾病机理的研究。至今已经利用果蝇建立人类疾病模型至少上百种，比如常见的帕金森症、老年痴呆症模型等。因此，果蝇在人类疾病研究中是非常有用的模型。果蝇中的人类GRM6同源基因为mtt和mGluR，因此可利用mtt和mGluR基因对GRM6基因进行深入研究。
技术实现思路
本专利技术发现了mtt基因在促进果蝇模拟表现CSNB和构建CSNB果蝇模型中的新用途。经本专利技术人试验发现，GRM6基因新的突变位点p.R192Q能引发CSNB，并且进一步试验发现利用果蝇中与GRM6基因同源的mtt基因，可得到与突变位点p.R192Q对应的突变位点p.R217Q，上述两个基因包含突变氨基酸的片段序列为：因此，以此发现为基础构建获得CSNB果蝇模型，该CSNB果蝇模型可用于研究该病的病理进程和机制，也可用于大规模筛选延缓或治疗该疾病的药物，具有很好的应用前景。本专利技术提供了mtt基因在促进果蝇模拟表现CSNB中的应用，所述mtt基因包含p.R217Q突变氨基酸的片段为：180VTSIQVANLLRLFRIPQVSYFSTSPELSNKQRFEYFSRTIPSDHYQVKAMVEIVKRMGWS238。本专利技术还提供了mtt基因在构建CSNB果蝇模型中的应用，所述mtt基因包含p.R217Q突变氨基酸的片段为：180VTSIQVANLLRLFRIPQVSYFSTSPELSNKQRFEYFSRTIPSDHYQVKAMVEIVKRMGWS238。本专利技术进一步提供了一种CSNB果蝇模型的构建方法，包括：（1）构建一对CRISPR/Cas9基因编辑靶点：靶点1和靶点2；（2）制备分别包含有所述靶点1、靶点2的两个重组质粒，以及供体DNA质粒；（3）将两个所述重组质粒和所述供体DNA质粒注入到表达Cas9蛋白的果蝇胚胎中，胚胎培育成虫后，获得F0代果蝇；（4）将F0代果蝇与平衡系进行杂交，从后代中获得CSNB果蝇；其中，所述靶点1序列为：5’-GAGTGATCCGAGGGAATAGTG-3’；所述靶点2序列为：5’-GCTCGGATCACTACCAGGTGA-3’。进一步地，构建所述供体DNA质粒包含一组引物，包括：5’同源臂引物：mtt-5arm-f：5’-AGCACTTACGCAGAAGCTGT-3’；mtt-5arm-r：5’-ATGGTCGCTCGGGATGGTCTGCGAGAAGTACTCGAATCGCTG-3’；3’同源臂引物：mtt-3arm-f：5’-GCAGACCATCCCGAGCGACCATTACCAGGTGAAGGCCATGGT-3’；mtt-3arm-r：5’-CCAGTTCCTCGAAAGCctga-3’。进一步地，步骤（4）中使用一组鉴定引物来获得所述CSNB果蝇，所述鉴定引物包括：mtt-KI-f：5’-CTGTCTTGCCATGAGCATTTGAC-3’；mtt-KI-r：5’-ATGGTCGCTCGGGATGGTCTGC-3’。本专利技术还提供了一种采用上述构建方法构建得到的CSNB果蝇模型。本专利技术提供的CSNB果蝇模型表型为复眼发生异常、感光能力下降。本专利技术还提供了CSNB果蝇模型在药物筛选中的应用。进一步地，上述药物为治疗人类CSNB疾病的药物。与现有技术相比，本专利技术具有以下有效效果：（1）本专利技术发现了GRM6基因中与CSNB相关的新突变位点p.R192Q，并经试验在同源基因mtt基因上得到了与之相应的突变位点p.R217Q，利用上述发现进一步试验构建mtt氨基酸突变的CSNB果蝇模型，利用CRISPR/Cas9系统，优化设计了一对靶点，并将两个靶点序列分别构建到两个载体上并获得两个靶点质粒，同时优化构建了一个供体DNA质粒，将所有靶点质粒、供体DNA质粒注入到果蝇胚胎中，获得了F0代果蝇，将其与平衡系杂交后，后代采用特定的鉴定序列鉴别，得到CSNB果蝇，在对研究CSNB的病理进程与机制具有重要意义，并且该构建方法具有操作简单、可重复性的优点。（2）本专利技术得到CSNB果蝇具有严重的病理表型，以及多种易于观察的表型的特点，根据该特点可以建立有效的病理评估手段，便于研究CSNB的病理进程和机制，也可用于大规模筛选延缓或治疗该疾病的药物，具有很好的应用前景。附附图说明附图1mtt果蝇模型基因编辑设计方案。附图2mtt果蝇模型基因编辑靶点克隆流程附图。附图3mtt果蝇模型分子鉴定附图。附图4mtt果蝇模型眼睛表型异常。附图5mtt果蝇模型感光能力降低。附图6mtt果蝇模型筛选药物技术流程附图。具体实施方式实施例（1）mtt突变位点的选择：根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Mtt基因在促进果蝇模拟表现CSNB中的应用，其特征在于，所述mtt基因包含p.R217Q突变氨基酸的片段为：/n180 VTSIQVANLLRLFRIPQVSYFSTSPELSNKQRFEYFSRTIPSDHYQVKAMVEIVKRMGWS 238。/n

【技术特征摘要】
1.Mtt基因在促进果蝇模拟表现CSNB中的应用，其特征在于，所述mtt基因包含p.R217Q突变氨基酸的片段为：
180VTSIQVANLLRLFRIPQVSYFSTSPELSNKQRFEYFSRTIPSDHYQVKAMVEIVKRMGWS238。


2.Mtt基因在构建CSNB果蝇模型中的应用，其特征在于，所述mtt基因包含p.R217Q突变氨基酸的片段为：
180VTSIQVANLLRLFRIPQVSYFSTSPELSNKQRFEYFSRTIPSDHYQVKAMVEIVKRMGWS238。


3.一种CSNB果蝇模型的构建方法，其特征在于，包括：
构建一对CRISPR/Cas9基因编辑靶点：靶点1和靶点2，
所述靶点1序列为：5’-GAGTGATCCGAGGGAATAGTG-3’；
所述靶点2序列为：5’-GCTCGGATCACTACCAGGTGA-3’；
（2）制备分别包含有所述靶点1、靶点2的两个重组质粒，以及供体DNA质粒；
（3）将两个所述重组质粒和所述供体DNA质粒注入到表达Cas9蛋白的果蝇胚胎中，胚胎培育成虫后，获得F0代果蝇；
（4）将F0代果蝇与平衡系进行杂交，从后代中获得CSNB果蝇。


4.根据权利要求3所述的一种CSNB果蝇模型的构建方法，其特征在于，构建所述供体DNA
质粒包含一组引物，包括：
5’...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文锋，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35