一种鸭源鸡杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种鸭源鸡杆菌和用该菌制备的灭活疫苗，保藏编号为CCTCC NO:M 2020272的鸭源鸡杆菌YT‑1株所制备的疫苗能够用于预防鸭源鸡杆菌引起的种鸡产蛋下降、受精率下降和输卵管炎疾病，从而填补我国没有鸭源鸡杆菌疫苗的空白。本发明专利技术通过对临床上蛋种鸡和肉种鸡经人工授精后出现产蛋下降的病例进行了病原的分离鉴定与纯化，得到了一株鸭源鸡杆菌，经过细菌的分离培养、特异性PCR鉴定和16s rRNA序列分析及动物回归试验，确定所筛选的细菌为鸭源鸡杆菌，并用该菌株制备的灭活疫苗免疫鸡群，结果表明，该苗能够有效预防临床上由鸭源鸡杆菌引起的产蛋下降和输卵管炎等疾病。

【技术实现步骤摘要】
一种鸭源鸡杆菌及其应用
本专利技术属于禽类疫苗制备
，具体涉及一种鸭源鸡杆菌和用该菌制备的灭活疫苗。
技术介绍
Kjos-Hansen等在1950年首次报道了鸡杆菌，Christensen等于2003年将巴氏杆菌科中的鸭巴氏杆菌、输卵管炎巴氏杆菌和溶血性巴氏杆菌单独成立为鸡杆菌属，Bisgaard等于2009年进一步将鸭源鸡杆菌明确为鸡杆菌属的一个代表种。鸡、火鸡、鸭、鹅、鹦鹉、鹧鸪和珍珠鸡等各种禽类中都可以分离出鸡杆菌，从具有不同临床症状的禽类中也可以分离到不同的鸡杆菌属细菌。研究表明，鸡杆菌可以从健康的禽类中分离到，有人认为这些细菌可能是上呼吸道和下生殖道正常微生物群的一部分；与此相反，kohlert和mirle等从患生殖系统疾病的蛋鸡中亦可分离到鸡杆菌，并认为该病原菌是开产蛋鸡输卵管炎、输卵管囊肿和败血症的潜在致病菌，进而导致产蛋量和蛋的品质下降；另一项研究则表明某些禽杆菌引起鸡心内膜炎、鼻窦炎或者上呼吸道感染。此外，该病原菌还能造成患有免疫抑制疾病的鸡群较高的死亡率。国内关于该菌的研究主要局限于菌株分离培养特性，但对于该菌在临床上的危害以及实验室相关动物回归试验数据尚无人论证，王川庆等于2008年首次报道了鸭源鸡杆菌在我国的存在，郑鹿平等于2010年从64只患输卵管炎鸡的不同脏器中分离鉴定到45株鸭源鸡杆菌，方翟等于2014年从患腺胃肿大的10日龄雏鸡腺胃内分离到1株鸭源鸡杆菌。研究表明鸭源鸡杆菌能够引起鸡输卵管囊肿和产蛋量下降，但对受精率无影响。自2000年以来，我国一些规模化种鸡场每批鸡群在开产后人工授精均会出现产蛋量和孵化率双双下降的情况，并且有愈演愈烈的趋势，给养鸡企业造成了巨大的经济损失，因鸭源鸡杆菌血清型众多，初步猜测该病可能与新血清型的鸭源鸡杆菌有关。为有效防控该病，筛选新的血清型鸭源鸡杆菌就迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸭源鸡杆菌和用该菌制备的灭活疫苗，该鸭源鸡杆菌所制备的疫苗能够用于预防鸭源鸡杆菌引起的种鸡产蛋下降、受精率下降和输卵管炎疾病，从而填补我国没有鸭源鸡杆菌疫苗的空白。本专利技术首先提供一种鸭源鸡杆菌(Gallibacteriumanatis)YT-1株，已经于2020年7月3日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2020272；本专利技术所提供的鸭源鸡杆菌为YT-1株用于制备疫苗；所述的疫苗，为灭活疫苗。本专利技术另一个方面还提供一种鸭源鸡杆菌灭活疫苗，包含有灭活的鸭源鸡杆菌菌株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为鸭源鸡杆菌(Gallibacteriumanatis)YT-1株；其中灭活疫苗中的抗原含量约为12.5亿/mL；其中鸭源鸡杆菌是使用甲醛溶液进行灭活。所述的疫苗佐剂为水相佐剂。本专利技术的灭活疫苗，其制备方法如下：1)菌液培养：采用发酵罐对鸭源鸡杆菌YT-1株进行培养，获得细菌液；2)菌液灭活：将收获的菌液加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.3％，4℃条件灭活96小时；3)抗原液制备：根据菌体计数结果，将灭活的YT-1株用无菌PBS缓冲液调整到12.5亿/mL；4)制苗：取抗原液95份导入乳化罐内，开动电机慢速转动搅拌，同时加入MONTANIDE·GEL·02佐剂5份，加入后搅拌充分混匀。本专利技术通过对临床上蛋种鸡和肉种鸡经人工授精后出现产蛋下降的病例进行了病原的分离鉴定与纯化，得到了一株鸭源鸡杆菌，经过细菌的分离培养、特异性PCR鉴定和16srRNA序列分析及动物回归试验，确定所筛选的细菌为鸭源鸡杆菌，并用该菌株制备的灭活疫苗免疫鸡群，结果表明，该苗能够有效预防临床上由鸭源鸡杆菌引起的产蛋下降和输卵管炎等疾病。附图说明图1：发病鸡群临床症状图；图2菌落在TSA、血平板及革兰氏染色后光学显微镜下图；图3：PCR扩增结果电泳图；图4：基于鸭源鸡杆菌16srRNA基因序列的遗传进化分析图，其中图中黑色圆圈代表试验分离的鸭源鸡杆菌YT-1株；图5：基于鸭源鸡杆菌OmpA基因氨基酸序列的遗传进化分析图，其中图中黑色圆圈代表试验分离的鸭源鸡杆菌YT-1株；图6：鸭源鸡杆菌YT-1株与参考毒株OmpA基因氨基酸比对图；图7：动物回归试验图；图8：攻鸭源鸡杆菌后病鸡生殖系统病变及蛋壳质量变化图，其中A图中右侧虚线框内为试验2组和4组所产鸡蛋，左侧为试验5组所产鸡蛋。具体实施方式本专利技术从山东、辽宁和河南采集发病种鸡疑似样品，通过病毒和细菌的分离鉴定以及动物回归试验，确定了引起开产种鸡人工授精后产蛋量下降和孵化率下降的病原为鸭源鸡杆菌，进而为该病的深入研究奠定了基础，这对该病的防控具有重要意义。下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细的描述。实施例1：细菌株的分离1、基本情况：2019年10月至今，山东、辽宁、河南、广西地区的蛋种鸡和肉种鸡场出现了一种以开产鸡群人工授精后产蛋下降、蛋壳质量变差为特征的新发传染病。鸡群感染后一般无明显临床症状，开产鸡群尤其是上高峰的鸡群感染后会出现持续性减料现象，10g～20g不等，同时伴随着产蛋率下降，蛋壳质量变差，白壳蛋和软皮蛋增多(图1-C)，此过程一般持续2周左右，到达最低点稳定几天后，开始恢复，采食量回升，产蛋率上升，但升不到发病前的水平，此过程亦持续2周左右，整个病程为5周～7周。期间部分病鸡表现为精神萎靡，闭目缩颈(图1-E)，拉水样料便或乳黄色粘稠稀便(图1-D)，部分鸡产蛋停止，一般无明显死亡现象，部分鸡群因管理不当造成死淘略高于正常。死亡鸡只和发病鸡只剖检主要表现为肝脏呈红黄相间的条纹状坏死、卵泡破裂、卵子充血、输卵管囊肿、输卵管内有黄白色干酪样分泌物(图1-A，B)，其它脏器无明显变化。2、病毒分离：无菌采集病鸡输卵管、卵泡和肝脏等组织，弃掉卵泡内卵黄，将卵泡膜、输卵管和肝脏剪碎后，加入适量生理盐水，匀浆器匀浆后加双抗各1000U，反复冻融3次，4℃、8000r/min离心15min，吸取上清液，0.22μm滤器过滤除菌。将上述滤液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚20枚，12日龄SPF鸭胚20枚，0.2mL/枚。接种后置于37℃生化培养箱恒温孵化。弃掉24h内死亡的鸡胚和鸭胚，连续观察5d，收获接种24h后的鸡胚尿囊液和鸭胚尿囊液，－80℃冻存备用。按照上述方法盲传3代。3、支原体的分离培养检测：无菌取病鸡输卵管、卵泡，将卵泡内卵黄弃掉，用无菌生理盐水冲洗数遍后用高压灭菌后的研钵研磨输卵管和卵泡膜，加入适量的无菌生理盐水充分涡旋，4℃静置1h，取上清用0.45μm无菌滤器过滤除菌后经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，37℃培养7d。弃掉24h内死亡的鸡胚，收获接种24h后的鸡胚卵黄膜。并连续盲传3代。结果表明66份样品接种SPF鸡胚和SPF鸭胚，经盲传3代，均无死亡现象，胚体无异常，尿囊液无血凝活性，无疑似病毒；经卵黄囊接种后，均未分离检测到支原体。4、细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭源鸡杆菌，其特征在于，所述的鸭源鸡杆菌的保藏编号为CCTCC NO： M2020272。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸭源鸡杆菌，其特征在于，所述的鸭源鸡杆菌的保藏编号为CCTCCNO：M2020272。


2.权利要求1所述的鸭源鸡杆菌在制备疫苗中的应用。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。


4.一种鸭源鸡杆菌灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原包含有灭活的权利要求1所述的鸭源鸡杆菌。


5.如权利要求4所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的抗原含量为12.5亿/mL。


6.如权利要求4所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭源鸡杆菌是使用甲醛溶液进行灭活...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉杰，刘东，刘红祥，郭玉广，高天佐，杜元钊，赵鹏，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37