本发明专利技术公开了尖孢镰刀菌的RT‑QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法，属于生物技术领域。上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；试剂盒包括上述引物及探针。荧光定量PCR检测方法包括：提取待测样品总DNA；制备反应体系；将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用引物和探针进行荧光定量PCR扩增；绘制标准曲线，计算结果。本发明专利技术的引物、探针及试剂盒，具有高度特异性和良好的灵敏度，能快速、准确度地尖孢镰刀菌进行检测。
【技术实现步骤摘要】
尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法
本专利技术属于生物
，具体涉及尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物、探针、试剂盒及方法。
技术介绍
尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)可侵染多种植物引起维管束萎蔫病害，对农业生产造成严重威胁。是植物根腐病的主要致病菌，能对三七、天麻、太子参、棉花等产生危害。尖孢镰刀菌能侵入植物根部引起根腐或侵入植物维管束系统导致植物萎蔫枯死，并在植物全生长过程中均可发生，其他菌株虽能侵入根部但不能侵入植物维管束系统引起病害。该病会造成根部腐烂，导致植物吸收水分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡，主要表现为整株叶片发黄、枯萎。尖孢镰刀菌具有易变异以及多型性的特点，种内生力分化十分明显，在种下又可分为多个专化性和生理小种，因此镰刀菌的遗传多样性一直是研究的热点。多年来，人们都是依据形态学特征、致病性及营养体融合群等试验来研究该菌的的多态性，而这些方法既费时又费力又不能准确地揭示物种的进化关系。现有技术中，采用多重PCR检测尖孢镰刀菌虽然特异性好、准确性高，然而其PCR结果需要通过琼脂糖电泳进行分析，影响因素较多。随着分子生物学技术的不断发展，RT-QPCR(实时荧光定量PCR)目前已广泛应用于菌种的检测。其与常规的分离培养方法相比，具有耗时短、操作简便、特异性好的特点，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。但尖孢镰刀菌与其它镰刀属菌种有着较高的同源性，如腐皮镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌。因此提供一种用于尖孢镰刀菌的PCR检测方法，具有高度特异性，准确度高，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，特异性好，准确度高。本专利技术的目的之二在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的探针。本专利技术的目的之三在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒。本专利技术的目的之四在于，提供一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术通过对NCBI数据库中尖孢镰刀菌18SrRNA基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，并进一步应用Primerexpress3软件、PrimerPremier5软件以及Oligo7软件，设计了多组实时荧光定量PCR引物与探针，经过试验初步筛选，最终确定了一组用于检测尖孢镰刀菌的荧光定量PCR引物和探针。本专利技术所述的尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'。本专利技术所述的尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的探针，该探针的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'；优选地，所述探针5’端标记的荧光报告基团为VIC，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。18SrRNA基因广泛存在于尖孢镰刀菌中，具有很高的保守性。本专利技术采用尖孢镰刀菌18SrRNA基因作为靶序列，合成了引物及探针。本专利技术所述的尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物及探针组合，包括：上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'；探针：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'。本专利技术所述的一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒，包括上述的引物、及探针。本专利技术的技术方案中，该试剂盒还包括QPCR模板，该QPCR模板如SEQIDNO:4所示；优选地，所述模板是以质粒的形式存在。本专利技术的引物和探针扩增片段对应质粒合成的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，具体为：5’-CGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTCTGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGC-3’。本专利技术的实施例中，该试剂盒还包括阴性样品；优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。本专利技术的实施例中，还包括预混液；优选地，所述预混液为2×ProbeMix。本专利技术所述的尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的反应体系，其包括：上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'；探针：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'；模板：如SEQIDNO:4所示；优选地，还包括阴性对照样品，进一步优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。本专利技术所述的检测植物尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测方法，包括以下步骤：步骤1.提取待测样品总DNA；步骤2.制备反应体系，所述反应体系如上所述；步骤3.将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；步骤4.将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用所述引物和探针，进行荧光定量PCR扩增；步骤5.绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值计算结果；优选地，所述步骤3中，梯度稀释制得的标准曲线样品的浓度分别为3.1×109copies/μL、3.1×108copies/μL、3.1×107copies/μL、3.1×106copies/μL、3.1×105copies/μL、3.1×104copies/μL、3.1×103copies/μL、3.1×102copies/μL、3.1×101copies/μL；优选地，所述阳性对照样品的浓度为3.1×1010copies/μL。本专利技术的实施例中，PCR反应条件：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，95℃15s、60℃40s、72℃20s并收集荧光信号，40个循环。作为本专利技术的一个实施例，PCR反应体系为：2×probeMix10μLPrimerF(10μM)0.4μLPrimerR(10μM)0.4μLTaqManProbe(10μM)0.2μL模板2μLddH2OUpto20μL。本专利技术的技术方案中，采用PCR技术扩增尖孢镰刀菌18SrRNA基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体PUC57中，构建出重组质粒PUC57-18SrRNA，并进行相应的PCR鉴定和本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，/n上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；/n下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'。/n
【技术特征摘要】
1.尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，
上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；
下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'。
2.尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'；优选地，所述探针5’端标记的荧光报告基团为VIC，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。
3.尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的引物及探针组合，其特征在于，包括：
上游引物：5'-ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT-3'；
下游引物：5'-AGAGGACCCCTAAACTCTG-3'；
探针：5'-ATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'。
4.一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物、及权利要求2所述的探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括QPCR模板，所述QPCR模板如SEQIDNO:4所示；优选地，所述模板是以质粒的形式存在。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性样品；优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。
7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括预混液；优选地，所述预混液为2×ProbeMix。
8.一种尖孢镰刀菌的RT-QPCR检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙宗科，朱建宁，张镭，沈颂东，车团结，石勇，高恺，李潇玲，郑晓玲，
申请(专利权)人：兰州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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