嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A在制备细胞凋亡模型中的应用制造技术

本发明专利技术公开了嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A在制备细胞凋亡模型中的应用。本发明专利技术发现嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A可以诱导细胞的凋亡，嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A处理细胞后，采用流式细胞学和形态学(电镜)结果证实嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A能够诱导细胞发生凋亡，嗜麦芽窄食单胞菌OmpA可以上调线粒体内凋亡蛋白的表达，下调抗凋亡蛋白的表达水平，即嗜麦芽窄食单胞菌OmpA可以使凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl‑xL表达下调，引起线粒体的膜通透性发生改变，Cyt c和AIF进入胞浆，继而通过激活凋亡元件Caspase‑3,开启细胞凋亡线粒体途径。

【技术实现步骤摘要】
嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A在制备细胞凋亡模型中的应用
本专利技术涉及生物
中，嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A在制备细胞凋亡模型中的应用。
技术介绍
嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)属于非发酵革兰阴性菌，广泛分布于自然界，也寄居于人体呼吸道及粪便中，是临床常见的条件致病菌。嗜麦芽窄食单胞菌作为一种机会致病菌，尽管其毒力不强，但常可在免疫力低下的人群中引起严重的呼吸道感染及其它各系统感染，如血流感染、脑膜炎、心内膜炎、软组织感染、关节炎及泌尿道感染。嗜麦芽窄食单胞菌感染的危险因素包括，恶性肿瘤、有创医疗操作的使用、慢性呼吸系统疾病、广谱抗生素的使用、长期住院、免疫力低下或免疫抑制剂的使用等，近年来，嗜麦芽窄食单胞菌引起的医院感染呈逐年上升趋势。外膜蛋白(outermembraneprotein，OMP)是存在于革兰阴性菌中的特殊蛋白质，位于细胞膜表面或镶嵌于细胞膜，外膜蛋白除具有免疫原性外，与细菌的致病性密切相关。外膜蛋白A为革兰阴性菌的主要外膜蛋白，与疾病的发生及机体免疫密切相关。嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A(OmpA)是其外膜蛋白中数量最多的外膜蛋白。细胞凋亡是细胞主动死亡的过程,涉及基因的激活、表达和调控等事件。细胞凋亡的途径包括线粒体凋亡途径和死亡受体介导途径及溶酶体凋亡途径等。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何制备细胞凋亡模型。本专利技术首先提供了细胞凋亡模型的制备方法，所述方法包括：利用嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A(记为SmltompA)处理细胞，得到细胞凋亡模型。上述方法中，所述嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A可为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表：标签的序列上述A2)中的蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的蛋白质。上述方法中，所述细胞可为哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞可为人细胞。所述人细胞可为人喉细胞。进一步，所述人喉细胞可为人喉上皮细胞，如HEp-2细胞。本专利技术还提供了嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A或调控所述嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A含量和/活性的物质的下述任一应用：X1、调控细胞凋亡；X2、制备调控细胞凋亡产品。上述应用中，所述嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A可为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本专利技术还提供了与嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A相关的生物材料的下述任一应用：X1、调控细胞凋亡；X2、制备调控细胞凋亡产品；所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：B1)编码嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；b12)序列表中序列2所示的DNA分子；b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A的cDNA分子或DNA分子；b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A的cDNA分子或DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码SmltompA蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的SmltompA蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SmltompA蛋白质且具有SmltompA蛋白质功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5分钟，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细胞凋亡模型的制备方法，包括：利用嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A处理细胞，得到细胞凋亡模型。/n

【技术特征摘要】
1.细胞凋亡模型的制备方法，包括：利用嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A处理细胞，得到细胞凋亡模型。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述细胞为哺乳动物细胞。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述哺乳动物细胞为人细胞。


5.嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A或调控所述嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A含量和/活性的物质的下述任一应用：
X1、调控细胞凋亡；
X2、制备调控细胞凋亡产品。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述嗜麦芽窄食单胞菌外膜蛋白A为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。


7.与嗜麦芽窄食单胞菌外...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，王鑫，尚学义，曾雄飞，严勇，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第五医学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11