一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法技术

一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，该多肽的精氨酸的两侧均设有一半胱氨酸，两个半胱氨酸形成二硫键，且所述二硫键横跨所述精氨酸。本发明专利技术对多肽中需进行保护的精氨酸的两侧，选择适当的位点插入半胱氨酸或者将不重要的氨基酸突变为半胱氨酸，使两个半胱氨酸横跨拟保护的精氨酸形成二硫键。通过二硫键带来的构象变化，在酶切处形成空间位阻，降低胰蛋白酶和精氨酸羧基端的亲和力，大幅减弱甚至消除酶切效应。

【技术实现步骤摘要】
一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法
本专利技术属酶工程
，涉及一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法。
技术介绍
胰蛋白酶是肽链内切酶，其酶切位点为/K/R-\P，可以对蛋白质氨基酸序列中的精氨酸和赖氨酸的C端进行酶切(如精氨酸/赖氨酸后面跟的是脯氨酸则不会发生酶切)。在酶切反应中，为了防止肽链中的赖氨酸被胰蛋白酶酶切，通常使用柠康酸酐或者马来酸酐与赖氨酸侧链上的ε氨基进行反应，保护赖氨酸C端不被胰蛋白酶酶切。但对于肽链中的精氨酸没有很好的保护手段，只能将精氨酸突变为其他氨基酸。如果氨基酸序列中精氨酸所处位置接近该蛋白本身的活性中心位点，或其本身为发挥其活性的关键残基，该突变可能导致目标蛋白的活性降低甚至失活。因此，有必要设计一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，该多肽的精氨酸的两侧均设有一半胱氨酸，两个半胱氨酸形成二硫键，且所述二硫键横跨所述精氨酸。优选的技术方案为：所述半胱氨酸为插入或突变得到。优选的技术方案为：在精氨酸的两侧均插入一半胱氨酸；或者将精氨酸的两侧的不重要的氨基酸突变为半胱氨酸；或者在精氨酸的一侧插入一半胱氨酸，另一侧的不重要的氨基酸突变为半胱氨酸；使两个半胱氨酸横跨待保护的精氨酸形成二硫键。优选的技术方案为：两个半胱氨酸间隔的氨基酸数目为n，n为大于或等于1，小于20的整数。优选的技术方案为：两个半胱氨酸间隔的氨基酸数目为n，n为大于或等于5，小于19的整数。优选的技术方案为：所述多肽的序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有的优点是：本专利技术对多肽中需进行保护的精氨酸的两侧，选择适当的位点插入半胱氨酸或者将不重要的氨基酸突变为半胱氨酸，使两个半胱氨酸横跨拟保护的精氨酸形成二硫键。通过二硫键带来的构象变化，在酶切处形成空间位阻，降低胰蛋白酶和精氨酸羧基端的亲和力，大幅减弱甚至消除酶切效应。附图说明图1为多肽一酶切前后分子量检测图谱。图2为多肽二酶切前后分子量检测图谱。图3为多肽三酶切前后分子量检测图谱。图4为多肽一序列。图5为多肽二序列。图6为多肽三序列。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效。请参阅图1-6。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本专利技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本专利技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本专利技术所揭示的
技术实现思路
得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。实施例1：一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，结构为：多肽一：SOD片段1+精氨酸+GLP1序列+GCGGGGGG+SOD片段2。其中，SOD片段1序列为：ATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGP；GLP1(7-37aa)序列为：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRG，其中第33位的V被突变为C，为了和GCGGGGGG中的C交联形成二硫键。野生型GLP1的C端没GCGGGGGG这段序列，在设计基因时候连在后面，可以称为linker。SOD片段2序列为：MATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEG。该多肽的精氨酸的两侧均设有一半胱氨酸，两个半胱氨酸形成二硫键，所述二硫键横跨所述精氨酸。其中“SOD片段1”和“GCGGGGGG+SOD片段2”为融合蛋白，目的是促进蛋白表达时包涵体的形成。在变复性完成后，通过胰酶的酶切效应，SOD片段1被切除。形成包含GLP1、link、C端融合片段的GLP-1类似物分子。该分子由于C端结构的变化，相比于野生型的GLP1，在抗DDP4降解的半衰期上有所延长，从而在体内降糖效果上相对于野生型GLP1有显著提高。多肽一序列如图4所示。对比例：多肽二：SOD蛋白片段1+精氨酸+GLP1序列+GCGGGGGG+SOD片段2其中，SOD片段1序列为：ATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGP；GLP1(7-37aa)序列为：HAEGTFTSDVSCYLEGQAACEFIAWLVKGRG；其中第18位的S、第26位的K被突变为C，为了交联形成链内二硫键。SOD片段2的序列为：MATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGP；多肽二序列如图5所示。多肽二的分子设计原理和思路和多肽一类似，但在GLP1分子内突变二硫键的位点选择上有所区别。实施例2：一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法多肽三：SOD蛋白片段1+精氨酸+GLP1序列+GCGGGGGG+SOD片段2SOD片段1序列为ATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGP；GLP1序列为(7-37aa)HAEGTFTSDVSCYLEGQAAKEFIAWLVKGRGC。其中第18位的S被突变为C，在37位G后面加上一个C。SOD片段2序列为MATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEG。多肽三序列如图6所示。按以下步骤分别考察多肽一，多肽二和多肽三中的精氨酸能否被胰蛋白酶酶切。合成编码基因：通过基因合成公司合肥吉象生物技术有限公司合成目的基因序列。序列如下：序列1：CATATGGGTAGCAGTCATCATCATCATCACCATAGCAGCATGGCCACCAAAGCAGTGAGTGTGCTGAAAGGTGATGGCCCGGTTCAGGGTATTATTAATTTTGAACAGAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，该多肽的精氨酸的两侧均设有一半胱氨酸，两个半胱氨酸形成二硫键，且所述二硫键横跨所述精氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，该多肽的精氨酸的两侧均设有一半胱氨酸，两个半胱氨酸形成二硫键，且所述二硫键横跨所述精氨酸。


2.根据权利要求1所述的在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：所述半胱氨酸为插入或突变得到。


3.根据权利要求2所述的在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：在精氨酸的两侧均插入一半胱氨酸；或者将精氨酸的两侧的不重要的氨基酸突变为半胱氨酸；或者在精氨酸的一侧插入一半胱氨酸，另一侧的不重要的氨基酸突...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏，孙磊，郑之明，吕荟，王丽，王晗，赵根海，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽;34