一种丙腈类化合物在增强溶酶体生成中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物制药领域，特别涉及一种丙腈类化合物在增强溶酶体生成中的应用。该丙腈类化合物通过抑制14‑3‑3蛋白与TFEB蛋白结合，减少TFEB

【技术实现步骤摘要】
一种丙腈类化合物在增强溶酶体生成中的应用
本专利技术属于生物制药领域，特别涉及一种丙腈类化合物在增强溶酶体生成中的应用。
技术介绍
14-3-3(YWHA，tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenaseactivationprotein)是一类广泛表达的调控信号通路的蛋白家族，可以结合目标蛋白特定的磷酸化位点，改变目标蛋白的亚细胞分布、磷酸化状态和活化状态等，调节许多重要细胞生命活动，如：新陈代谢、细胞周期、细胞生长发育、细胞凋亡等。哺乳动物的14-3-3蛋白共有7个亚型(β、ε、η、γ、θ、σ、ζ)，每种亚型在不同类型组织中的表达量不同，各有其特殊的功能。14-3-3β蛋白(YWHAB)是14-3-3蛋白家族中含量最高的成员，参与生物体内多种信号转导、蛋白跨膜转运等过程。14-3-3β可与多种蛋白相互作用，与神经系统疾病的病理形成过程密切相关。TFEB(transcriptionfactorEB)是调控溶酶体生成的重要转录因子，被誉为溶酶体基因的“MasterRegulator”。TFEB的转录活性取决于其亚细胞定位，受到翻译后修饰和蛋白-蛋白相互作用的精确调控。在营养充足的条件下，TFEB磷酸化，与14-3-3产生相互作用而滞留在胞质；在饥饿或者溶酶体功能障碍的状态下，TFEB去磷酸化，与14-3-3分离并进入胞核，进而激活TFEB靶向基因的转录，从而激活溶酶体生成。因此，14-3-3是TFEB亚细胞定位的关键调控因子。溶酶体生成和功能障碍是阿尔兹海默症等神经退行性疾病的重要发病机制。溶酶体是神经元内物质代谢的主要场所，某些衰老的细胞器和生物大分子等陷入溶酶体内并被消化掉是维持神经元稳态的关键因素之一。在中枢神经系统，溶酶体生成和功能异常可诱发阿尔兹海默症(AD)、帕金森氏病(PD)等诸多神经退行性疾病，动物实验研究发现，增加溶酶体生成，调节溶酶体功能可以有效加强AD模型鼠的神经元的突触可塑性，加强毒性蛋白的降解，增强其学习和认知功能。当前的MTOR抑制剂，如torin1和雷帕霉素(rapamycin)通过抑制MTOR蛋白促进TFEB的细胞核转运来激活TFEB。诸如海藻糖和蔗糖之类的二糖以非MTOR依赖性方式,通过抑制AKT通路从而激活TFEB并且可以有益于神经退行性疾病。然而，直接靶向调控14-3-3蛋白从而调节TFEB介导的溶酶体生成的小分子化合物尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术基于已报道14-3-3β/TFEBp-S211复合物晶体结构(PDBID:6A5Q)，确定了TFEBp-S211磷酸化位点通过疏水作用、静电作用和氢键作用与14-3-3β结合(14-3-3β关键氨基酸残基：Lys51/Arg58/Arg129/Tyr130)，并发现在二者结合界面S211附近的部分氨基酸也影响YWHA/14-3-3与TFEB的相互作用，进而调控TFEB的亚细胞定位和转录活性，相关溶酶体的生成以及细胞自噬水平，阻断Aβ25-35诱导神经毒性，并为制备治疗神经退化性疾病药物提供了启发思路。本专利技术的目的在于提供强效的TFEB激活作用以用于治疗神经退行性疾病的小分子化合物，其具有简单的化学结构并且容易大规模合成。该化合物直接通过抑制14-3-3蛋白与TFEB蛋白结合，激活TFEB通路，从而增强溶酶体生成。本专利技术还提供了一种用于治疗可以受益于溶酶体功能障碍的方法，所述病症和疾病主要包括神经退行性疾病。本专利技术目的之一：提供一种具有阻断作用的组合物，具体技术方案为：一种能阻断Aβ25-35诱导神经毒性的组合物，其特征在于，所述组合物由Ⅰ所示结构式的化合物和Neuro-2a细胞组成。进一步地，Ⅰ所示结构式的化合物具体制备过程：2-氰乙基肼与苯乙酮在乙酸中反应6小时，缩合。所得产物与三氯磷酸在0-65℃下反应3小时；Vilsmeier-哈克反应得到3-(4-甲酰基-3-苯基-1H-吡唑-1-基)丙腈。最后与巴比妥酸在乙醇中加热反应得到终产物，反应式如式所示：进一步地，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。优选的，所述化合物的摩尔浓度为40μM。进一步地，所述化合物的预处理时间大于2小时。本专利技术目的之二：提供一种运用Ⅰ所示结构式的化合物靶向结合14-3-3β蛋白的方法，具体步骤如下：(1)细胞培养和靶向结合14-3-3β蛋白：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理；(2)检测Ⅰ所示结构式的化合物靶向结合14-3-3β蛋白情况及靶向结合14-3-3β蛋白的区域。进一步地，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。具体的，所述化合物的摩尔浓度为40μM。进一步地，所述化合物的预处理时间大于2小时。进一步地，所述靶向结合14-3-3β蛋白的区域为TYR130、ASP126、ASN175、LYS122、SER47。本专利技术目的之三：提供一种阻断Aβ25-35诱导神经毒性的方法，具体技术方案为：一种运用Ⅰ所示结构式的化合物阻断Aβ25-35诱导神经毒性的方法，步骤如下：(1)细胞培养和阻断诱导神经毒性：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入诱导神经毒性的Aβ25-35；(2)检测细胞增殖和死亡情况。进一步地，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。进一步地，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。优选的，所述化合物的摩尔浓度为40μM。进一步地，所述化合物的预处理时间大于2小时。本专利技术目的之四：提供一种抑制TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合的方法，具体技术方案为：一种运用Ⅰ所示结构式的化合物抑制TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合的方法，步骤如下：(1)细胞培养和增强TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入诱导神经毒性的Aβ25-35；(2)检测TFEBTFEB-YWHA/14-3-3集合情况。进一步地，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。进一步地，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。优选的，所述化合物的摩尔浓度为40μM。进一步地，所述化合物的预处理时间大于2小时。本专利技术目的之五：提供一种诱导TFEB核转位的方法，具体技术方案为：一种运用Ⅰ所示结构式的化合物诱导TFEB核转位的方法，具体步骤如下：(1)细胞培养和抑制TFEB核表达：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入抑制核TFEB表达的Aβ25-35；(2)检测TFEB核转位情况。进一步地，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。进一步地，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。优选的，所述化合物的摩尔浓度为40μM。进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能阻断Aβ25-35诱导神经毒性的组合物，其特征在于，所述组合物由Ⅰ所示结构式的化合物和Aβ25-35诱导神经毒性的Neuro-2a细胞组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种能阻断Aβ25-35诱导神经毒性的组合物，其特征在于，所述组合物由Ⅰ所示结构式的化合物和Aβ25-35诱导神经毒性的Neuro-2a细胞组成。





2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。


3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述化合物的摩尔浓度为40μM。


4.一种运用Ⅰ所示结构式的化合物靶向结合14-3-3β蛋白的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)细胞培养和靶向结合14-3-3β蛋白：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理；
(2)检测Ⅰ所示结构式的化合物靶向结合14-3-3β蛋白情况及靶向结合14-3-3β蛋白的区域。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。


6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化合物的摩尔浓度为40μM。


7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化合物的预处理时间大于2小时。


8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶向结合14-3-3β蛋白的区域为TYR130、ASP126、ASN175、LYS122、SER47。


9.一种运用Ⅰ所示结构式的化合物阻断Aβ25-35诱导神经毒性的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)细胞培养和阻断诱导神经毒性：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入诱导神经毒性的Aβ25-35；
(2)检测细胞增殖和死亡情况。


10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。


11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述化合物的摩尔浓度范围为10μM-40μM。


12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述化合物的摩尔浓度为40μM。


13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述化合物的预处理时间大于2小时。


14.一种运用Ⅰ所示结构式的化合物抑制TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)细胞培养和增强TFEB蛋白与YWHA/14-3-3蛋白结合：Neuro-2a细胞培养基中加入Ⅰ所示结构式的化合物进行预处理，再混入诱导神经毒性的Aβ25-35；
(2)检测TFEBTFEB-YWHA/14-3-3结合情况。


15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述Aβ25-35的摩尔浓度为100μM。


16.根据权利要求14所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：皮会丰，邓平，余争平，张涛，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50