具有对FcRn的亲和力提高以及对至少一个Fc片段受体的亲和力提高的Fc片段的变体制造技术

本发明专利技术涉及包含Fc片段的亲本多肽的变体，所述变体相对于亲本多肽，对FcRn受体的亲和力提高以及对选自FcγRI(CD64)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIla(CD32a)受体的至少一个Fc受体(FcR)的亲和力提高，所述变体的特征在于其包含：(i)四个突变334N、352S、378V和397M；和(ii)至少一个选自434Y、434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389T和389K的突变；其中编号是EU索引或Kabat等价的编号。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有对FcRn的亲和力提高以及对至少一个Fc片段受体的亲和力提高的Fc片段的变体本专利技术涉及包含突变的Fc区并相对于亲本多肽对FcRn受体亲和力提高以及对至少一个Fc受体(FcR)的亲和力提高的多肽(也称为变体)。抗体由重链和轻链的四聚体组成。两条轻链彼此相同，同时两条重链相同并且由二硫键连接。存在五种类型的重链(α、γ、δ、ε、μ)，其决定了免疫球蛋白类型(IgA、IgG、IgD、IgE、IgM)。轻链组包括两个亚组，λ和κ。IgG是可以在血液和其他体液中发现的可溶性抗体。IgG是Y-形糖蛋白，具有大约150kDa的分子量，由两条重链和两条轻链组成。每条链由恒定区和可变区组成。重链的两个羧基末端结构域形成Fc片段，而重链和轻链的氨基末端结构域识别抗原并且被称为Fab片段。通过抗体Fc片段与提供对给定的治疗靶标的特异性的蛋白质结构域的结合形成Fc融合蛋白。实例是Fc片段与任何类型的治疗性蛋白或其片段的结合。Fc多肽，特别是Fc片段，治疗性抗体和Fc融合蛋白，目前用于治疗各种疾病，如类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化和许多形式的癌症。治疗性抗体可以是单克隆或多克隆抗体。单克隆抗体获自单个抗体产生细胞系，其显示出对单个抗原的相同特异性。作为对抗自身免疫疾病和/或炎性组分的药物来使用或研发治疗性Fc融合蛋白，所述药物如依那西普(etanercept)(Amgen'sEnbrel，其是结合FC的TNF受体)或阿列法西普(Alefacept)(BiogenIdec'sAmevive，其是结合人IgG1的Fc部分的LFA-3)。Fc多肽，如Fc片段，Fc抗体和融合蛋白特别地具有取决于Fc部分与其受体的结合的活性，即，FcRn和Fc片段受体(FcR)，如FccγRI(CD64)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIla(CD32a)受体。在涉及Fc多肽与Fc片段受体(FcR)相互作用的疗法中，期望的作用之一是通过结合效应细胞表面上的Fc受体来抑制免疫系统激活。特别是在涉及自身抗体和/或细胞因子的炎性和/或自身免疫性疾病的治疗中，基于Fc的疗法可以通过阻断Fc受体从而与自身抗体竞争进入这些受体来起作用。这导致通常由自身抗体介导的直接活性(例如抗体依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性或抗体依赖性细胞吞噬作用)的抑制，以及免疫系统的激活降低，包括细胞因子释放。另外，由于FcRn受体参与抗体的再循环，因此用Fc多肽阻断它们可以更快地消除自身抗体，从而降低其半衰期。这就是为什么基于Fc片段的治疗特别适合由免疫系统细胞不受控制的刺激(尤其是自身抗体和/或细胞因子)触发的自身免疫和/或炎性疾病的原因。提议用于这些疾病治疗的基本疗法是静脉内免疫球蛋白(IVIG或IVIg)疗法，该疗法包括向患者静脉内施用来自人血浆捐赠池的免疫球蛋白(最常见是IgG)。通常认为这些IgG特别是通过阻断Fc受体并因此与自身抗体竞争进入这些受体而起作用。最近，已研发出Fc片段，用于修饰其Fc受体结合特性的目的。然而，它们的有效性仍有待证明。仍然需要优化这些Fc片段，特别是提高其半衰期和/或其治疗功效。申请人现在已研发出呈现提高的活性的特定Fc片段，特别是通过提高的FcRn结合亲和力。这些Fc片段可用于治疗，并且特别适合炎性和/或自身免疫疾病的治疗，以便为包含它们的产品带来更大的功效。特别地，这些片段可以呈现出更有效的对免疫系统细胞上存在的Fc受体的阻断，然后其较少的或不再可用于自身抗体的结合，然后其活性被抑制。另外，Fc片段使得有可能更有效地阻断FcRn受体，从而更快地消除自身抗体。另外，如在实施例中所证实的，这些特定的Fc片段中的一些具有比IVIG更好的补体依赖性细胞毒性(CDC)的抑制。因此，它们有可能降低病原性自身抗体的毒性，如炎性和/或自身免疫疾病中涉及的那些。本专利技术因此提供了关于由Fc区介导的功能活性具有优化特性的亲本多肽的变体。本专利技术因此涉及包含Fc片段的亲本多肽的变体，所述变体相对于亲本多肽对FcRn受体的亲和力提高以及对选自FcγRI受体(CD64)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIla(CD32a)的至少一个Fc受体(FcR)的亲和力提高，特征在于所述变体包含：(i)四个突变334N、352S、378V和397M；和(ii)至少一个选自434Y、434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389T和389K的突变；其中编号是EU索引或Kabat等价的编号。根据一个实施方案，根据本专利技术的变体进一步在Fc片段中包含至少一个选自以下的突变(iii)：Y296W、K290G、V240H、V240I、V240M、V240N、V240S、F241H、F241Y、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、F243L、F243S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、V259C、V259I、V259L、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、S267A、S267Q、S267V、K290D、K290E、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、R292I、R292L、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、Q295I、Q295M、Y296H、S298A、S298R、Y300I、Y300V、Y300W、R301A、R301M、R301P、R301S、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303S、V303Y、S304T、V305A、V305F、V305I、V305L、V305R和V305S，其中编号是EU索引或Kabat等价的编号。将这样的变体称为“根据本专利技术的变体”、“根据本专利技术的突变体”或“根据本专利技术的多肽”。优选，根据本专利技术的变体具有对FcRn受体提高的亲和力以及对所有FcγRI(CD64)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIa(CD32a)受体提高的亲和力。优选，此外，根据本专利技术的变体能够抑制补体依赖性细胞毒性(CDC)，这归因于结合补体蛋白(特别是C1q)的修饰。与IVIG给予的相比，这种抑制显著提高。优选，根据本专利技术的变体不同于由Fc片段(特别是IgG1的)组成的变体，其具有五个突变N434Y、K334N、P352S、V397M和A378V，并且在HEK293细胞中产生，其中编号是EU索引或Kabat等价的。因此，优选，根据本专利技术的变体不同于在HEK293细胞中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含Fc片段的亲本多肽的变体，所述变体相对于亲本多肽，对FcRn受体的亲和力提高以及对选自FcγRI(CD64)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIla(CD32a)的至少一个Fc受体(FcR)的亲和力提高，所述变体的特征在于其包含：/n(i)四个突变334N、352S、378V和397M；和/n(ii)至少一个选自434Y、434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389T和389K的突变；/n其中编号是EU索引或Kabat等价的编号。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171215 FR 17622171.包含Fc片段的亲本多肽的变体，所述变体相对于亲本多肽，对FcRn受体的亲和力提高以及对选自FcγRI(CD64)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIla(CD32a)的至少一个Fc受体(FcR)的亲和力提高，所述变体的特征在于其包含：
(i)四个突变334N、352S、378V和397M；和
(ii)至少一个选自434Y、434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389T和389K的突变；
其中编号是EU索引或Kabat等价的编号。


2.根据权利要求1的变体，在Fc片段中进一步包含至少一个选自以下的突变(iii)：Y296W、K290G、V240H、V240I、V240M、V240N、V240S、F241H、F241Y、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、F243L、F243S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、V259C、V259I、V259L、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、S267A、S267Q、S267V、K290D、K290E、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、R292I、R292L、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、Q295I、Q295M、Y296H、S298A、S298R、Y300I、Y300V、Y300W、R301A、R301M、R301P、R301S、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303S、V303Y、S304T、V305A、V305F、V305I、V305L、V305R和V305S，
其中编号是EU索引或Kabat等价的编号。


3.根据权利要求1或2的变体，特征在于其包含：
(i)四个突变334N、352S、378V和397M；和
(ii)至少一个选自434Y、434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389T和389K的突变；和
(iii)至少一个选自K290G和Y296W的突变，
其中编号是EU索引或Kabat等价的编号。


4.根据权利要求1至3任一项的变体，相对于亲本多肽，对FcRn受体的亲和力提高至少等于2，优选高于5，更优选高于10，甚至更优选高于15，特别优选高于20，甚至更特别地优选高于25，最优选高于30的比例。


5.根据权利要求1至4任一项的变体，相对于亲本多肽，对选自受体FcγRI(CD64)、FcγRIIIa(CD16α)和FcγRIla(CD32α)的至少一个Fc受体(FcR)的亲和力提高至少等于2，优选高于5，更优选高于10，甚至更优选高于15，特别优选高于20，甚至更特别地优选高于25，最优选高于30的比例。


6.根据权利要求1至5任一项的变体，特征在于在转基因非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生。


7.根据权利要求1至6任一项的变体，特征在于在转基因非人动物中，优选在转基因非人哺乳动物中产生。


8.根据权利要求7的变体，特征在于所述转基因非人动物是转基因山羊。


9.根据权利要求1至8任一项的变体，特征在于亲本多肽包含亲本Fc片段，其是人Fc片段，优选是人IgG1或人IgG2的Fc片段，更优选选自序列SEQIDNO:1至10和14。


10.根据权利要求1至9任一项的变体，特征在于其选自分离的Fc片段、源自分离的Fc片段的序列、抗体、包含Fc片段的抗体片段和包含Fc片段的融合蛋白。


11.根据权利要求1至10任一项的变体，针对选自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、毒素、膜或循环细胞因子、膜受体的抗原。


12.根据权利要求1至11任一项的变体，用作药物。


13.根据权利要求1至11任一项的变体，用于自身免疫或炎性疾病的治疗中，所述自身免疫或炎性疾病优选选自免疫性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎或Devic疾病和多发性硬化症。


14.药物组合物，包含根据权利要求1至13任一项的变体和至少一种药物学上可接受的赋形剂。


15.生产包含Fc片段的亲本多肽的变体的方法，所述变体相对于亲本多肽，对FcRn受体的亲和力提高以及对选自受体FcγRI(CD64)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIla(CD32a)的至少一个Fc受体(FcR)的亲和力提高，所述变体的特征在于其包含：
(i)四个突变334N、352S、378V和397M；和
(ii)至少一个选自434Y、434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、24...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·米德，C·莫内，P·蒙东，
申请(专利权)人：法国血液分割暨生化制品实验室，
类型：发明
国别省市：法国;FR