一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化葡萄糖氧化酶及其在检测葡萄糖中的应用，属于葡萄糖检测技术领域。本发明专利技术是以氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米为载体，吸附葡萄糖氧化酶制得该固定化葡萄糖氧化酶(GOD@ADMSNs)。制备过程中，利用三乙胺调控介孔二氧化硅纳米材料的结构，得到孔径均一、尺寸为200nm，孔隙为10～25nm的树枝状介孔二氧化硅纳米材料，该材料具有树枝状皱襞孔隙，其大小与葡糖糖氧化酶分子大小相似，载体上面的氨基与酶分子上的羧基结合，而不影响酶的活性位点，使固定化酶保持较高的活性和较高的重复使用性。在重复检测葡萄糖36次后，GOD@ADMSNs的活性仍在80％以上，与有关报道的固定化葡萄糖氧化酶相比，重复检测次数显著增加，极大降低了检测的使用成本。
【技术实现步骤摘要】
一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定葡萄糖氧化酶及其在检测葡萄糖中的应用
本专利技术属于葡萄糖检测
，具体涉及一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化葡萄糖氧化酶及其在检测葡萄糖中的应用。
技术介绍
葡萄糖是动植物碳水化合物的主要成分，葡萄糖的定量测定在生命科学中占有重要地位，葡萄糖的检测方法主要有分光光度法、安培法、高效液相色谱法、极谱法和毛细管电泳法等，但多数存在耗时、昂贵的缺点。酶是一类具有较高催化活性的生物催化剂，有较高的底物特异性，葡萄糖氧化酶可催化β-D-葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和过氧化氢，酶法检测葡萄糖具有准确快速，灵敏度高的特点。近年来，葡萄糖氧化酶法已广泛应用于生物化学、临床化学及食品分析中葡萄糖的检测，酶在正常条件下表现出很高的选择性和反应性，但对pH和温度较敏感而易失活，游离酶价格昂贵使用一次后不能回收利用，增加了使用成本。酶的固定化在很大程度上能够解决此类问题，固定化葡萄糖氧化酶检测葡萄糖具有反应时间短、保存期较长、灵敏度高、反应快捷等优点。酶固定化方法有物理法和化学法两大类，其中物理法包括吸附法和包埋法,化学法包括共价结合法和交联法等。由于传统方法所制备的固定化葡萄糖氧化酶的酶活保留率较低，固定化葡萄糖氧化酶在使用一定时间及次数后，酶活力明显下降，大大降低了酶的应用性能。因此有必要寻求一种合适的载体，来固定葡萄糖氧化酶，使固定化葡萄糖氧化酶具有更高的的重复使用性，更高的稳定性，从而达到降低使用成本的目的。介孔二氧化硅具有可调的孔径尺寸和结构、比表面积高、孔隙率高、热稳定性和机械稳定性高、本身无毒等特点，可在粒子表面进行选择性功能化。其中，树枝状介孔二氧化硅纳米材料具有树枝状空腔结构，因而具有更高的孔渗透性、更大的孔体积、更好的粒子内表面的可接触性。因而成为一种优良的酶固定化载体。树枝状介孔二氧化硅纳米材料是一种特殊形貌的酶固定化载体，比传统的介孔二氧化硅材料增加了优势：(1)它的整体形貌为树枝状，开放性好，内有树枝状空腔，存在10～25nm的内部外部堆积孔。(2)可调控性强，由于表面含有裸露的硅羟基，能够和功能化硅烷缩合，形成带有功能基团(巯基、氨基、羧基)的表面，且可调控其形貌，包括纳米粒子大小、孔径大小等。本专利技术利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷对树枝状介孔二氧化硅纳米材料进行修饰氨基，合成氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米材料。(3)材料稳定性较高，不易被破坏。(4)较大的比表面积可以提高酶的蛋白载量。这些性能都充分说明树枝状介孔二氧化硅纳米材料是一种优良的酶固定化载体。
技术实现思路
本专利技术的目的是合成一种氨基化的树枝状介孔二氧化硅纳米材料，并用此材料作为载体来固定葡萄糖氧化酶，载体上的氨基与葡萄糖氧化酶分子上的羧基结合，克服现有的酶固定化技术酶活保留率低，重复使用性低的问题。树枝状介孔二氧化硅具有较大的孔道、较高的比表面积和良好的生物相容性，因此具有较大的蛋白负载潜力。然而，使用这些纳米颗粒固定化酶的应用很少有报道。本专利技术的另一目的是提供以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化葡萄糖氧化酶在血糖及饮料样品中检测葡萄糖方面的应用。该方法具有稳定性高、反应时间短、灵敏度高、重复使用次数显著提高的效果，以及成本低、温度、酸碱适用范围广等优于天然游离酶的优点。为了实现上述目的，制备出具有稳定性高，灵敏度高，检测快速，重复利用率高的固定化葡萄糖氧化酶，本专利技术提供以下技术方案：一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化葡萄糖氧化酶，是以氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米为载体，吸附葡萄糖氧化酶制得的固定化葡萄糖氧化酶，载体上的氨基与葡萄糖氧化酶上的羧基结合，酶分子不易脱落，增加了固定化酶的重复使用次数，而且具有传输阻力小、制备效率高、分离效果好等的优点，其是由如下步骤制备得到：(1)树枝状介孔二氧化硅纳米材料(DMSNs)的制备：将0.68g三乙胺溶于15～30mL超纯水，75～85℃下水浴25～35min；然后加入0.38g十六烷基三甲基溴化铵和0.16g水杨酸钠，75～85℃下水浴25～35min；再加入4mL体积分数98％的正硅酸乙酯，75～85℃下水浴1.5～2.5h；降至室温后离心，沉淀用超纯水和乙醇洗涤后干燥，经萃取去除模板剂(十六烷基三甲基溴化铵)，得到树枝状介孔二氧化硅纳米材料，记为DMSNs；(2)氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米载体(ADMSNs)的制备：将0.3～0.5g步骤(1)制备的DMSNs加到60～100mL甲苯中，加热至澄清后再加入0.3～0.5mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，DMSNs与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的用量比例为1g:1mL，加热回流3～5h，降至室温后离心，沉淀用甲苯清洗，干燥后研磨得到氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米载体，记为ADMSNs；(3)固定葡萄糖氧化酶：不同浓度葡萄糖氧化酶溶液(0.1～0.6mg/mL)配制方法：准确称取葡萄糖氧化酶0.05g，用50mM的pH＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至50mL，得到浓度为1mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液；再用50mM的pH＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液将浓度为1mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液稀释成不同浓度(0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL)。取6份10mg步骤(2)得到的ADMSNs，分别加入到10mL浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液中；然后在转速为150～200r/min，4℃的水浴磁力搅拌器上搅拌4～12h，离心8000rpm，3min，所得沉淀用50mM的pH5.0乙酸-乙酸钠缓冲液洗涤2次，经冷冻干燥机冻干，得到以氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米材料为载体的固定化葡萄糖氧化酶，记为GOD@ADMSNs；(4)显色液配制：A液：0.015g4-氨基安替比林溶于50mL的pH＝5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；B液：0.103g苯酚溶于50mL超纯水，A液与B液混合后加入2mg辣根过氧化物酶即可。不同浓度葡萄糖标准溶液配制：将50mg葡萄糖用超纯水溶解定容至100mL得到浓度为1mg/mL的葡萄糖标准溶液，再用超纯水稀释成不同浓度的葡萄糖标准溶液(浓度分别为0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.010mg/mL、0.050mg/mL、0.100mg/mL、0.500mg/mL)。(5)将6份步骤(3)得到的质量为3mg的GOD@ADMSNs分别加入到3mL步骤(4)得到的显色液，0.5mL超纯水，0.5mL步骤(4)得到的浓度分别为0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.010mg/mL、0.050mg/mL、0.100mg/mL、0.500mg/mL的葡萄糖标准溶液中，40℃的150～200rpm的水浴磁力搅拌器上反应15～30min；离心，取上清液，用紫外分光光度计测定上清液在505nm处的吸光度值，然后以葡萄糖标准溶液的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化葡萄糖氧化酶，其是由如下步骤制备得到：/n(1)树枝状介孔二氧化硅纳米材料的制备：将0.68g三乙胺溶于15～30mL超纯水，75～85℃下水浴25～35min；然后加入0.38g十六烷基三甲基溴化铵和0.16g水杨酸钠，75～85℃下水浴25～35min；再加入4mL体积分数98％的正硅酸乙酯，75～85℃下水浴1.5～2.5h；降至室温后离心，沉淀用超纯水和乙醇洗涤后干燥，经萃取去除模板剂，得到树枝状介孔二氧化硅纳米材料，记为DMSNs；/n(2)氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米载体的制备：将0.3～0.5g步骤(1)制备的DMSNs加到60～100mL甲苯中，加热至澄清后再加入0.3～0.5mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，DMSNs与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的用量比例为1g：1mL，加热回流3～5h，降至室温后离心，沉淀用甲苯清洗，干燥后研磨得到氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米载体，记为ADMSNs；/n(3)固定葡萄糖氧化酶：取6份10mg步骤(2)得到的ADMSNs，分别加入到10mL浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液中；然后在转速为150～200r/min，4℃的水浴磁力搅拌器上搅拌4～12h，离心，所得沉淀用50mM的pH＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液洗涤后冻干，得到以氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米材料为载体的固定化葡萄糖氧化酶，记为GOD@ADMSNs。/n...
【技术特征摘要】
1.一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化葡萄糖氧化酶，其是由如下步骤制备得到：
(1)树枝状介孔二氧化硅纳米材料的制备：将0.68g三乙胺溶于15～30mL超纯水，75～85℃下水浴25～35min；然后加入0.38g十六烷基三甲基溴化铵和0.16g水杨酸钠，75～85℃下水浴25～35min；再加入4mL体积分数98％的正硅酸乙酯，75～85℃下水浴1.5～2.5h；降至室温后离心，沉淀用超纯水和乙醇洗涤后干燥，经萃取去除模板剂，得到树枝状介孔二氧化硅纳米材料，记为DMSNs；
(2)氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米载体的制备：将0.3～0.5g步骤(1)制备的DMSNs加到60～100mL甲苯中，加热至澄清后再加入0.3～0.5mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，DMSNs与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的用量比例为1g：1mL，加热回流3～5h，降至室温后离心，沉淀用甲苯清洗，干燥后研磨得到氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米载体，记为ADMSNs；
(3)固定葡萄糖氧化酶：取6份10mg步骤(2)得到的ADMSNs，分别加入到10mL浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液中；然后在转速为150～200r/min，4℃的水浴磁力搅拌器上搅拌4～12h，离心，所得沉淀用50mM的pH＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液洗涤后冻干，得到以氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米材料为载体的固定化葡萄糖氧化酶，记为GOD@ADMSNs。
2.如权利要求1所述的一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化葡萄糖氧化酶，其特征在于：不同浓度葡萄糖氧化酶溶液的配制，是准确称取葡萄糖氧化酶0.05g，用50mM的pH＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至50mL，得到浓度为1.0mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液；再用50mM的pH＝5.0乙酸-乙酸钠缓冲液将浓度为1.0mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液稀释成0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的浓度。
3.如权利要求2所述的一种以氨基化树枝状介孔二氧化硅为载体的固定化葡萄糖氧化酶，其特征在于：50mM的pH＝5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液的配制，是首先称取4.1...
【专利技术属性】
技术研发人员：王润伟，王春艳，王欢，田牧晓，于蕙源，所金泉，王媛，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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