检测猪瘟病毒的RT-RAA引物、探针和试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测猪瘟病毒的RT‑RAA引物、探针和试剂盒及应用，所述检测猪瘟病毒的RT‑RAA引物和探针包括用于鉴定猪瘟病毒5’NTR基因的正向引物CSFV‑5’NTR‑F(SEQ ID NO.1)、反向引物CSFV‑5’NTR‑R(SEQ ID NO.2)和探针CSFV‑5’NTR‑Probe(SEQ ID NO.3)。通过上述引物和探针进行RT‑RAA核酸扩增所得到的扩增结果可以通过便携式蓝光仪进行肉眼可视化判断，可实现对CSFV进行快速、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有检测技术的不足。

【技术实现步骤摘要】
检测猪瘟病毒的RT-RAA引物、探针和试剂盒及应用
本专利技术是关于动物疫病检测
，特别是关于一种检测猪瘟病毒的RT-RAA引物、探针和试剂盒及应用。
技术介绍
猪瘟(classicalswinefever,CSF)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，特征为高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死，具有很高的发病率和死亡率，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类法定传染病之一。猪是本病原唯一的自然宿主，病猪和带毒猪是最主要的传染源。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业巨大的经济损失。近年来猪瘟流行和发病特点发生了许多新变化，出现非典型猪瘟、温和型猪瘟，散发性流行，发病特点及临床症状轻或不明显，死亡率低，病理变化不特征，而且常呈隐性感染，给临床确诊带来了很大的困难，须依赖实验室诊断才能确诊。为了降低猪瘟给养猪业带来的巨大经济损失，需要快速、准确的诊断技术。目前，冰冻切片直接荧光抗体(FA)试验是检查CSFV抗原的方法之一，扁桃体是首选病料，此外血清中和试验、ELISA、PCR、动物接种试验如兔体交互免疫试验等方法，也是目前实验室较常用的检测方法，都可对猪瘟进行确诊，且对该病的诊断和防控发挥了重要作用。常规诊断方法存在操作复杂，需要复杂的仪器设备，所需时间长的缺点，不利于猪瘟的快速诊断，也不适合基层和现场即时检测(pointofcaretesting，POCT)。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高的猪瘟病毒检测方法，对该病的诊断和防控具有重要意义。重组酶介导的等温扩增反应(RecombinaseAidedAmplification,RAA)是一种新型的等温体外核酸扩增技术，反应在37-42℃条件下30min内即可得到与传统PCR反应相当的扩增产物。RAA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，从而对模板上的目标区域进行指数式扩增。RAA反应简单快速，对仪器要求简单，不需要热循环反应的温度控制仪器。在基础体系中添加逆转录酶，省去了额外的cDNA合成步骤，可以对RNA模板进行一步法扩增。利用exo探针技术和核酸外切酶III，能实现数据的实时读取，就像荧光定量PCR一样。将exo探针技术、核酸外切酶III和逆转录酶结合起来的exoRT-RAA，可以一步实现对RNA模板的实时扩增。该技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、能实现现场快速检测等特点。再根据探针中的FAM是一种绿色荧光基团，其在蓝光下可以被激发出绿色荧光，因此可以结合便携式蓝光仪器对RAA扩增产物进行可视化的判断，适用于即时检测，是未来核酸检测方面具有推广应用前景的等温扩增技术。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测猪瘟病毒的RT-RAA引物和探针，通过所述引物和探针对猪瘟病毒实施逆转录重组酶介导等温扩增(Reversetranscriptionrecombinase-aidedamplification，RT-RAA)，以实现对猪瘟病毒进行快速、特异、灵敏、可视化、简便的检测。为实现上述目的，本专利技术提供了一种检测猪瘟病毒的RT-RAA引物和探针，包括用于鉴定猪瘟病毒5’NTR基因的正向引物CSFV-5’NTR-F、反向引物CSFV-5’NTR-R和探针CSFV-5’NTR-Probe，所述正向引物CSFV-5’NTR-F、反向引物CSFV-5’NTR-R和探针CSFV-5’NTR-Probe的序列如下：正向引物CSFV-5’NTR-F：5’-ACTGGGCTAGCCATGCCCACAGTAGGACTAGCAAA-3’(SEQIDNO.1)，反向引物CSFV-5’NTR-R：5’-GCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGACGACTG-3’(SEQIDNO.2)，探针CSFV-5’NTR-Probe5’-ACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAG-3’(SEQIDNO.3)。在本专利技术的一实施方式中，所述探针CSFV-5’NTR-Probe自5’端起第31位碱基T标记FAM发光基团，第32位碱基C被四氢呋喃THF代替，第33位碱基T标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰。本专利技术还提供了一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述检测猪瘟病毒的RT-RAA引物和探针。在本专利技术的一实施方式中，所述试剂盒还包含逆转录重组酶介导等温扩增的试剂。在本专利技术的一实施方式中，所述试剂包括反应缓冲液、RNaseFreeddH2O、含有镁离子的缓冲液、和RT荧光基础反应单元。在本专利技术的一实施方式中，所述含有镁离子的缓冲液为醋酸镁，所述RT荧光基础反应单元包含单链DNA结合蛋白、重组酶、逆转录酶和聚合酶，优选的，所述RT荧光基础反应单元以冻干粉的形式存在。本专利技术还提供了上述检测猪瘟病毒的试剂盒在制备检测猪瘟病毒制剂中的应用，包括以下步骤：提取RNA：提取待测样品的RNA；RT-RAA反应体系扩增：以提取的RNA为模板，加入试剂盒中检测猪瘟病毒的RT-RAA引物和探针以及包含逆转录重组酶介导等温扩增的试剂组成RT-RAA反应体系进行RT-RAA扩增；以及结果判定：质控标准：阴性对照无扩增曲线或可视化结果为无色，且阳性对照出现扩增曲线或可视化结果为绿色，则实验数据有效，否则实验结果为无效；结果描述及判定：待检测样品无扩增曲线或可视化结果为无色，样品判为阴性；出现扩增曲线或可视化结果为绿色，样品判为阳性；其中，阴性对照中的模板加入的是RNaseFreeddH2O，阳性对照中的模板为已知CSFV毒株的RNA模板。在本专利技术的一实施方式中，所述RT-RAA反应体系的总体系为50μL，含有反应缓冲液29.4μL，10pmol/μLCSFV-5’NTR-F和CSFV-5’NTR-R各2μL，10pmol/μLCSFV-5’NTR-Probe0.6μL，RNaseFreeddH2O和待检测的样品RNA模板共13.5μL，醋酸镁2.5μL，RT荧光基础反应单元(包含单链DNA结合蛋白、重组酶、逆转录酶和聚合酶)。在本专利技术的一实施方式中，所述RT-RAA的反应条件为在42℃下恒温扩增30min。在本专利技术的一实施方式中，所述结果判定是通过蓝光检测仪器进行结果的可视化判断的，优选的，可视化结果是使用天根生化科技有限公司的便携式TGreenMonitor蓝光电泳监测仪(OSE-470M)在暗室中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猪瘟病毒的RT-RAA引物和探针，其特征在于，包括用于鉴定猪瘟病毒5’NTR基因的正向引物CSFV-5’NTR-F、反向引物CSFV-5’NTR-R和探针CSFV-5’NTR-Probe，所述正向引物CSFV-5’NTR-F、反向引物CSFV-5’NTR-R和探针CSFV-5’NTR-Probe的序列如下：/n正向引物CSFV-5’NTR-F：/n5’-ACTGGGCTAGCCATGCCCACAGTAGGACTAGCAAA-3’(SEQ ID NO.1)，/n反向引物CSFV-5’NTR-R：/n5’-GCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGACGACTG-3’(SEQ ID NO.2)，以及/n探针CSFV-5’NTR-Probe：/n5’-ACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAG-3’(SEQ ID NO.3)。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测猪瘟病毒的RT-RAA引物和探针，其特征在于，包括用于鉴定猪瘟病毒5’NTR基因的正向引物CSFV-5’NTR-F、反向引物CSFV-5’NTR-R和探针CSFV-5’NTR-Probe，所述正向引物CSFV-5’NTR-F、反向引物CSFV-5’NTR-R和探针CSFV-5’NTR-Probe的序列如下：
正向引物CSFV-5’NTR-F：
5’-ACTGGGCTAGCCATGCCCACAGTAGGACTAGCAAA-3’(SEQIDNO.1)，
反向引物CSFV-5’NTR-R：
5’-GCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGACGACTG-3’(SEQIDNO.2)，以及
探针CSFV-5’NTR-Probe：
5’-ACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAG-3’(SEQIDNO.3)。


2.如权利要求1所述的检测猪瘟病毒的RT-RAA引物和探针，其特征在于，所述探针CSFV-5’NTR-Probe自5’端起第31位碱基T标记FAM发光基团，第32位碱基C被四氢呋喃THF代替，第33位碱基T标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰。


3.一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的检测猪瘟病毒的RT-RAA引物和探针。


4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭鑫，涂飞，张永宁，杨汉春，盖新娜，周磊，韩军，陈艳红，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11