一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用方法技术

本发明专利技术提供一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记。其主要特征是，提取东北林蛙脚趾组织的基因组，以提取的基因组DNA为模板，以含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对进行PCR扩增反应。通过14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列（222bp）对应条带的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO:3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙。本发明专利技术其优点是，获得了东北林蛙遗传雄性特异性DNA分子标记，可快速、简便、准确地鉴定东北林蛙的遗传性别。本发明专利技术可获得伪雄个体，即生理为雄性，但遗传为雌性的个体。利用伪雄个体与雌性个体交配，其后代生理雌性的比例高达90%以上，可显著提高东北林蛙养殖的经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用方法
本专利技术涉及一种通过分子标记鉴定东北林蛙遗传性别的方法。
技术介绍
东北林蛙（RanaDybowskii）隶属于两栖纲（Amphibian）无尾目（Anura）蛙科（Ranidae）蛙属（Rana）。雌性东北林蛙，即《中药大辞典》中所述的中国林蛙，干燥后的输卵管被称为哈蟆油或林蛙油，是一种久负盛名的滋补中药。研究表明，经常服用林蛙油，可补充人体所需的18种必需氨基酸，增强体力和记忆力，增强对各种疾病的免疫功能。因为巨大的经济利益的驱使，人们长期以来对野生东北林蛙进行“灭绝式”抓捕。随着林蛙的野生资源越捕越少，个体越捕越小，而市场需求越来越大，市场价格逐年上涨，供需矛盾日益加剧，人们不得不寻求人工养殖林蛙之路。2010年，吉林省林蛙养殖产值达到15亿元。在东北林蛙养殖过程中，养殖群体雄性比例过高这一问题严重影响了东北林蛙养殖的经济效益。东北林蛙性别分化由遗传因素决定，同时受环境因素修饰，并在变态结束前完成，此后个体生理性别不再改变。由于环境因素对东北林蛙性别分化具有修饰作用，因此东北林蛙会出现遗传性别与生理性别不一致的个体，即性逆转个体。动物的性逆转个体在单性育种中具有非常重要的作用，已经成功运用于全雄罗非鱼和高雌半滑舌鳎等鱼类的单性生产中。东北林蛙的生理性别可以通过外部形态观察得以鉴定，但由于东北林蛙核型分析中未能观察到异型性染色体，所以无法对东北林蛙遗传性别进行鉴定，从而无法成功获得性逆转个体。性别特异性DNA分子标记是物种遗传性别鉴定有效载体。因此，获取一种能够鉴定东北林蛙遗传性别的DNA分子标记是构建全雌或高雌养殖群体的关键技术之一。然而，目前尚未见东北林蛙性别特异性DNA分子标记的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术中存在的问题，提供了一种鉴定东北林蛙遗传性别的DNA分子标记及鉴定方法。利用本专利技术的技术方案，可以确定东北林蛙的遗传性别。本专利技术的目的是这样实现的，其特征是，按以下步骤操作：（1）提取东北林蛙脚趾组织的基因组DNA，（2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR扩增反应所用上游引物为SEQIDNO:1所示序列，即5’-GGCTATTCGTCGCTACTAAAGG-3’，下游引物为SEQIDNO:2所示序列，即5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’。（3）用14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列对应条带，即图2所示的方框内条带，的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQIDNO:3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙。（4）对遗传雄性特异性条带进行回收纯化、测序，确定其为东北林蛙性别特异性分子标记，即SEQIDNO:3。所述分子标记表现为SEQIDNO:3所示核苷酸序列，GGCTATTCGTCGCTACTAAAGGTGGGGTCACTGGCACTTAATGCTGCCCAGTTCTGGGTCTCTAAAGAAGGACCGTTTAACATGAGAGTCTATGGGGAAACAGGGTCATCTTTAGGCATGTGCAGAAGTGAAAAATTTGTTTTGTTTCGTTTCGTTTCAATTCGTCATTTAATACATTTCGTTAAGTTAGGTTCGTTACATGTGTCAAATTCGTACGCAGTC本专利技术的有益效果在缺少全基因组数据作为参考，且无异型性染色体的情况下，需要鉴定东北林蛙遗传性别是非常困难的。利用性别特异性DNA分子标记是一种鉴定物种遗传性别的有效途径。本专利技术获得了一个东北林蛙遗传雄性特异性DNA分子标记，成功地鉴定出东北林蛙的遗传性别，并确定东北林蛙的性别决定类型为XY型。在生理雄性个体中，通过本专利技术鉴定，我们获得了缺失SEQIDNO:3所示核苷酸序列对应条带性逆转的伪雄个体，即生理为雄性，但遗传为雌性的个体。2019年春季，我们以伪雄个体为父本，以正常雌性为母本进行抱对，获得了2个受精卵团。从每个卵团取240个受精卵，在20℃件下孵化，并饲养至变态结束。通过解剖观察，鉴定变态幼蛙的生理性别。变态幼蛙生理性别雌雄比分别为：164/17和152/14，生理雌性所占比例分别为90.61%和91.57%。此验证性试验说明，东北林蛙性逆转为伪雄的个体，其子代在20℃温度条件下均能大多数发育为生理雌性。本专利技术能实现对东北林蛙养殖群体性别控制，从而提高东北林蛙养殖的经济效益。图1是本专利技术东北林蛙脚趾DNA的1.2%琼脂糖凝胶电泳图图2是本专利技术PCR扩增产物14%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图具体实施方式：下面结合实施例对本专利技术做进一步说明由图1可知，本实验所提取的部分DNA琼脂糖电泳检测结果，DNA片段完整，点样孔无大量蛋白存在，DNA无明显降解，说明DNA量较高，可以满足进一步分析的需要。由图2可知，泳道17为2000bp的marker；泳道1~16为生理雄性东北林蛙，泳道18~33为生理雌性东北林蛙。除了同时出现在雌性和雄性个体中的条带，其中泳道1,2,3,5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16具有一条222bp的性别特异性条带，即图2方框内所示条带，具有此条带的个体为遗传雄性个体。此条带在所有生理雌性个体，即泳道18~33和2个生理雄性个体，即泳道4、6，中均未出现，未出现此条带的个体为遗传雌性个体。泳道4和6的个体是生理雄性个体，但无此遗传雄性特异性条带，由此判定个体4和6为性逆转的伪雄个体，即生理为雄性，但遗传为雌性的个体。实施本专利技术的具体操作如下：1.提取东北林蛙脚趾组织的基因组（1）样品采集，将黑龙江省小兴安岭地区东北林蛙置于搪瓷盆，经蒸馏水冲洗两遍后，剪取左后肢趾尖，放入1.5ml离心管，加75%乙醇，-20℃保存备用。（2）实验试剂Tris-饱和酚、无水乙醇、70%乙醇；消化液：由pH8.0Tris-HCI100mmol/L，pH8.0EDTA5mmol/L，200mmol/LNaCI，0.2%SDS，0.1mg/mL蛋白酶K组成；TE缓冲液：由10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA组成，pH8.0；酚/氯仿/异戊醇混合液：酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1；氯仿/异戊醇混合液：氯仿、异戊醇体积比为24:1；（3）实验步骤a.取适量样品，于滤纸上晾干乙醇，置于1.5mlEP管中，用小剪刀将样品剪碎。平置EP管，至样品中乙醇挥发完毕；b.EP管中加入500μl裂解液，扣上盖，并用封口膜密封；c.水浴摇床，140rpm，55℃过夜消化；d.待裂解完全后，取出EP管，静置室温，加入等体积Tris-饱和酚，上下颠倒10min；e.12000rpm离心10min，小心吸取上层水相，置入新的EP管；f.加等体积酚：氯仿：异戊醇混合液，酚、氯仿、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是按以下步骤操作：/n（1）提取东北林蛙脚趾组织的基因组DNA，/n（2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR扩增反应所用上游引物为SEQ IDNO :1所示序列，即5’-GGCTATTCGTCGCTACTAAAGG-3’ ，下游引物为SEQ ID NO :2所示序列，即5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’；/n（3）用14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应的222bp条带的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙；/n（4）对遗传雄性特异性条带进行回收纯化、测序，确定其为东北林蛙性别特异性分子标记，即SEQ ID NO :3，所述分子标记表现为SEQ ID NO :3 所示核苷酸序列，/nGGCTATTCGTCGCTACTAAAGGTGGGGTCACTGGCACTTAATGCTGCCCAGTTCTGGGTCTCTAAAGAAGGACCGTTTAACATGAGAGTCTATGGGGAAACAGGGTCATCTTTAGGCATGTGCAGAAGTGAAAAATTTGTTTTGTTTCGTTTCGTTTCAATTCGTCATTTAATACATTTCGTTAAGTTAGGTTCGTTACATGTGTCAAATTCGTACGCAGTC/n具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的个体，表现为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO3所示核苷酸序列的个体为遗传雌性东北林蛙。/n...

【技术特征摘要】
1.一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是按以下步骤操作：
（1）提取东北林蛙脚趾组织的基因组DNA，
（2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR扩增反应所用上游引物为SEQIDNO:1所示序列，即5’-GGCTATTCGTCGCTACTAAAGG-3’，下游引物为SEQIDNO:2所示序列，即5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’；
（3）用14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列对应的222bp条带的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQIDNO:3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙；
（4）对遗传雄性特异性条带进行回收纯化、测序，确定其为东北林蛙性别特异性分子标记，即SEQIDNO:3，所述分子标记表现为SEQIDNO:3所示核苷酸序列，
GGCTATTCGTCGCTACTAAAGGTGGGGTCACTGGCACTTAATGCTGCCCAGTTCTGGGTCTCTAAAGAAGGACCGTTTAACATGAGAGTCTATGGGGAAACAGGGTCATCTTTAGGCATGTGCAGAAGTGAAAAATTTGTTTTGTTTCGTTTCGTTTCAATTCGTCATTTAATACATTTCGTTAAGTTAGGTTCGTTACATGTGTCAAATTCGTACGCAGTC
具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的个体，表现为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQIDNO3所示核苷酸序列的个体为遗传雌性东北林蛙。


2.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是，所述引物对具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列:
SEQIDNO:1
GGCTATTCGTCGCTACTAAAGG
SEQIDNO2:
GACTGCGTACGAATTTGA。


3.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，其特征是，利用所述引物对SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：许愿，狄生伟，宁方勇，白秀娟，杜智恒，刘珈羽，苏杭，徐逸男，吕晶，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23