化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体及其在辅酶再生中的应用制造技术

本发明专利技术涉及化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体及其在辅酶再生中的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术提供了巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶突变体，其编码基因、含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，突变体酶制剂的制备方法，以及该突变体酶制剂在氧化还原反应中参与辅酶NAD(P)H再生的实际应用。本发明专利技术得到了热稳定性和化学耐受性均显著提升的突变体，满足了工业应用的需求。本发明专利技术所述突变体不仅具有高的活性和热稳定性，而且还具有很好的化学耐受性，将更有助于含高浓度有机助溶剂或高浓度底物/产物的生物催化反应体系中的辅酶再生，在工业应用中显示出更加广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体及其在辅酶再生中的应用
本专利技术属于生物工程
，尤其是涉及化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体，其编码核酸，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，突变体酶制剂的制备方法，以及该突变体酶制剂在氧化还原反应中参与辅酶再生中的应用。
技术介绍
葡萄糖脱氢酶(Glucosedehydrogenase,GDH)是用于辅酶再生的一类重要工具酶。它能催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，同时将产生的氢负离子与电子受体NAD+或NADP+结合，生成还原型辅酶NADH或NADPH，从而实现还原型辅酶的循环再生。葡萄糖脱氢酶催化辅酶再生具有以下优点：(1)酶催化效率高；(2)双辅酶再生(NADH和NADPH)，(3)所使用的底物葡萄糖廉价易得；(4)对于NAD(P)+的Km较小，即与辅酶的亲和力大；(5)反应不可逆。上述的这些优点使得葡萄糖脱氢酶在辅酶再生的领域具有广泛的应用前景及潜力。为了满足工业应用日益增长的需求，从巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆获得了多种葡萄糖脱氢酶并于大肠杆菌中重组表达。并且已经详细研究了来自巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶的特征。在应用方面，Makino等人对来源于BacillusmegateriumIWG3的葡萄糖脱氢酶进行了化学诱变，得到了四株热稳定性提高的突变体E96A、E96G、Q252L和Y253C，其中E96A最稳定，与母本相比，热稳定性提高了大约20℃(FEBSLett.,1989,253:113-116)。Baik等人将来源于BacilluslicheniformisIFO12200，BacillusmegateriumIFO15308，BacillussubtilisIFO13719和来源于BacillusmegateriumIWG3的葡萄糖脱氢酶突变体Q252L通过DNAshuffling得到了一个热稳定性进一步提高的突变体Q252L/E170K(Appl.Environ.Microbiol.,2005,71:3285-3293)。通过上述分子改造，使得高活性天然葡萄糖脱氢酶突破了热稳定性差的瓶颈，从而使其在工业应用中具有更大的竞争优势。葡萄糖脱氢酶作为一种性能优良的辅酶再生工具酶，因其良好的催化活性和热稳定性，已经基本满足了大部分的实际应用需求。但在大规模工业应用中，催化体系中常常存在高浓度的疏水性底物或产物，导致葡萄糖脱氢酶快速失活，限制了其广泛应用。酶在高浓度疏水性底物或产物中的稳定性，通常称为化学耐受性或化学稳定性，类似于有机溶剂的耐受性。Ding等人发现来源于Lactobacillussalivarius的葡萄糖脱氢酶LsGDH在与水互溶的有机溶剂和双相溶剂系统中都表现出了较高的化学稳定性，但在正丁醇中却展现出很差的化学耐受性，使用10％(v/v)的正丁醇处理后，其活性几乎完全丧失(Bioresour.Technol.,2011,102:1528-1536)。研究人员也在酶有机溶剂耐受性方面做了大量改造工作，其中利用蛋白质工程来提高酶的有机溶剂耐受性已成为比较成熟的方法。酶工程的方法集中于改变蛋白质分子的一级序列，以产生在有机介质中具有优异稳定性和活性的酶突变体。但是，目前针对葡萄糖脱氢酶对于高浓度底物耐受性的改造工作还未见报道。通过定向进化等蛋白质工程技术对其结构进行分子改造，提高其化学稳定性及在高浓度化学品转化体系中的辅酶再生能力，有助于进一步降低酶催化生产成本、推动生物催化在医药、农药、材料、能源等领域中的更广泛应用。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的不足，本专利技术选择已报道具有高活性和热稳定性的BmGDHQ252L/E170K(PDB:1RWB)作为目标，通过蛋白质工程的手段对其进行进一步的分子改造，使用高浓度1-苯乙醇对突变库进行有机溶剂耐受性筛选，获得了对高浓度化学品耐受性显著提升的突变体，增强了该酶的应用性。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：技术方案之一，本专利技术提供对高浓度苯乙醇耐受性显著提升的葡萄糖脱氢酶突变体。以氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的葡萄糖脱氢酶BmGDH作为母本，通过随机突变的方法，结合酶标仪高通量初筛和进一步摇瓶复筛，鉴别获得多个对高浓度苯乙醇耐受性提高的突变体，与母本相比，优选的突变体不仅提高了其化学稳定性，在热稳定性方面也有所提高。本专利技术所述葡萄糖脱氢酶突变体，是将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白质的第23位甲硫氨酸、第41位赖氨酸、第47位丝氨酸、第72位缬氨酸、第74位天冬酰胺、第85位赖氨酸、第99位缬氨酸、第100位丝氨酸、第111位赖氨酸、第137位赖氨酸、第139位苏氨酸、第166位赖氨酸、第194位脯氨酸、第202位天冬氨酸、第210位谷氨酸或第213位异亮氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，所述衍生蛋白质对高浓度苯乙醇耐受性显著提升，在热稳定性方面也有所提高。具体的，所述葡萄糖脱氢酶突变体是如下序列中的一种：(1)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸；(2)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸；(3)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；(4)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；(5)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；(6)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；(7)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；(8)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第23位甲硫氨酸替换为缬氨酸，第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；(9)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；(10)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第137位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；(11)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第72位缬氨酸替换为异亮氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；(12)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第139位苏氨酸替换为丙氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；(13)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；(14)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，其是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质的第23位甲硫氨酸、第41位赖氨酸、第47位丝氨酸、第72位缬氨酸、第74位天冬酰胺、第85位赖氨酸、第99位缬氨酸、第100位丝氨酸、第111位赖氨酸、第137位赖氨酸、第139位苏氨酸、第166位赖氨酸、第194位脯氨酸、第202位天冬氨酸、第210位谷氨酸或第213位异亮氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，其是将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白质的第23位甲硫氨酸、第41位赖氨酸、第47位丝氨酸、第72位缬氨酸、第74位天冬酰胺、第85位赖氨酸、第99位缬氨酸、第100位丝氨酸、第111位赖氨酸、第137位赖氨酸、第139位苏氨酸、第166位赖氨酸、第194位脯氨酸、第202位天冬氨酸、第210位谷氨酸或第213位异亮氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。


2.根据权利要求1所述葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体是如下序列中的一种：
(1)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸；
(2)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(3)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(4)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(5)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；
(6)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(7)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(8)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第23位甲硫氨酸替换为缬氨酸，第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(9)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；
(10)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第137位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(11)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第72位缬氨酸替换为异亮氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸；
(12)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸，第139位苏氨酸替换为丙氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸；
(13)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(14)将如序列表中SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第47位丝氨酸替换为半胱氨酸，第85位赖氨酸替换为苏氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑高伟，钱雯卓，陈琦，许建和，李春秀，潘江，钱小龙，
申请(专利权)人：华东理工大学，苏州百福安酶技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31