一种转谷氨酰胺酶生产菌制造技术

本发明专利技术通过诱变得到了一种转谷氨酰胺酶生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020147或者CCTCC NO:M 2020148。本发明专利技术的转谷氨酰胺酶生产菌比原始菌株的转谷氨酰胺酶产酶量提高了4倍多，酶活达到7.5U/mL以上，能够工业化应用。

【技术实现步骤摘要】
一种转谷氨酰胺酶生产菌
本专利技术属于生物工程领域，具体地说，涉及一种转谷氨酰胺酶生产菌。
技术介绍
转谷氨酰胺酶(EC2.3.2.13，Transglutaminase，TGase)又称谷氨酰胺酶转氨酶(Glutaminetransaminase)，简称TG酶，是由331个氨基组成的分子量约38000的具有活性中心的单体蛋白质，在自然界中广泛存在于人体、高级动物、鱼类、植物和微生物中，例如大量存在于哺乳动物的各种组织器官(如肝脏、毛囊、表皮、前列腺、血液)。它是一种酰基转移酶，可通过催化蛋白质中赖氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羟酰胺基之间的结合反应(参见图1)，使蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价交联。作为一种通过转谷氨酰胺作用形成共价化合物的聚合酶，借助于两个蛋白质(包括乳清蛋白、麦胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋白和家禽类肌动球蛋白等)之间的交联反应，提高蛋白质的水溶性、起泡性、可搅拌性、热稳定性、乳化性等的功能特性。TG酶被称为“21世纪的超级粘合剂”，在食品、医药、纺织、化妆品等领域应用前景广阔。在食品领域，该酶能通过引入赖氨酸而提高蛋白质的营养效价，而被其处理过的食品具有良好的外观和质构，可延长货架期，减少食品中的过敏源。此外，该酶可分解谷氨酰胺生成谷氨酸和氨，而谷氨酸在食品美味上起着重要作用，因此通过添加该酶可增强食品的风味。传统肉类加工工艺通常加入大量的盐和磷酸，以提高其持水力、连贯性和质地。近些年来，少盐少磷酸的食物被广泛推广，但其质地和物理性质都不尽如人意。TG酶可以替代部分通常肉制品加工中添加的品质改良剂--磷酸盐，生产低盐肉制品。可应用于水产加工品、火腿、香肠、面类、豆腐等等。TG酶在40～45℃、pH6-7的条件下，只需添加0.1-0.3％的量，即可达到明显的效果。转谷氨酰胺酶主要通过微生物发酵法进行生产，所用的微生物是茂原链霉菌(Streptomycesmobaraense或Streptomycesmobaraensis)，是我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB2760)中唯一合法生产转谷氨酰胺酶的安全菌株。但目前使用的茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶生产能力偏低，导致发酵液中的酶含量偏低，因此亟需提高菌株的产酶能力。
技术实现思路
为了现有转谷氨酰胺酶生产菌株发酵水平低的缺陷，本专利技术结合化学诱变、物理诱变和杂交育种来筛选茂原链霉菌突变菌株，获得了高产转谷氨酰胺转氨酶的生产菌株。因此，本专利技术的第一个目的在于提供一种转谷氨酰胺酶生产菌。本专利技术的第二个目的在于提供上述转谷氨酰胺酶生产菌用于生产转谷氨酰胺酶的应用。为了达到上述目的，本专利技术对于上海东之汇生物科技有限公司所保藏的茂原链霉菌DSM40587设计了如下诱变筛选方案：1)活化原始菌株茂原链霉菌DSM40587；2)对菌株进行化学诱变比如亚硝基胍(NTG)诱变育种、或者物理诱变比如紫外线(UV)诱变育种、或者化学法与物理法相结合的诱变育种，筛选出转谷氨酰胺酶表达水平明显提高的突变菌株。上述步骤1)中使用的平板培养基(高氏一号)组成如下：20g/L可溶性淀粉，1g/LKNO3，0.5g/LNaCl，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.5g/LK2HPO4·3H2O，0.01g/LFeSO4·7H2O，琼脂粉2％。通过数百次的诱变实验，终于筛选出转谷氨酰胺酶产量提高了4倍多的两个突变菌株，分别命名为DSHO0618和NTG-1，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCCNO:M2020148(即DSHO0618)和CCTCCNO:M2020147(即NTG-1)。根据本专利技术的第二个方面，提供了上述转谷氨酰胺酶生产菌CCTCCNO:M2020147和CCTCCNO:M2020148在转谷氨酰胺酶的生产中的应用。在一种实施方式中，通过上述转谷氨酰胺酶生产菌的发酵来生产转谷氨酰胺酶。其中，发酵时所用的培养基可以是任何适用于茂原链霉菌生长发酵的培养基。根据本专利技术的优选实施例，发酵培养基组成如下：20g/L甘油，6g/L酵母粉，25g/L鱼粉蛋白胨，2g/LMgSO4·7H2O,2g/LK2HPO4·3H2O，NaOH调pH至7.4。在一种优选的实施方式中，当用于工业化发酵生产时，上述转谷氨酰胺酶生产菌进行发酵时包括种子培养阶段和菌体发酵阶段。这两个阶段分别使用种子培养基和发酵培养基，发酵培养基可以与种子培养基相同，也可以不相同，例如可以都是上述培养基组成。优选地，上述发酵温度为30±3℃比如30±2℃或30±1℃。本专利技术所构建的转谷氨酰胺酶生产菌通过发酵能够实现发酵液中转谷氨酰胺酶的有效积累，比原始菌株DSM40587的产酶量提高了至少4倍，完全可以投入工业化应用。本专利技术诱变筛选出的转谷氨酰胺酶生产菌的拉丁学名是Streptomycesmobaraensis，中文名称是茂原链霉菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2020年5月26日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号分别为CCTCCNO:M2020147和CCTCCNO:M2020148。附图说明图1为转谷氨酰胺酶的作用原理示意图。图2为转谷氨酰胺酶的酶活测定反应原理图。图3为诱变菌株DSHO0618和NTG-1的平板培养状态照片。其中左图为DSHO0618，右图为NTG-1，分别培养了72h。具体实施方式提高转谷氨酰胺酶生产菌的产酶量是本领域科技人员的多年追求。提高微生物表达蛋白质能力的一种重要手段是基因工程，即在细菌或者酵母中导入外源的转谷氨酰胺酶基因，通过转化子发酵来表达转谷氨酰胺酶。但是基因工程菌产品的食用安全性难以保障，需要长时期的系统考察才能确定；而且基因工程菌一般经数次传代后，遗传稳定性趋于下降。为了保障发酵产品转谷氨酰胺酶的食品级安全性，以及保持发酵菌株的遗传稳定性，专利技术人选择了传统的诱变育种手段对已获得食品安全认证的现有转谷氨酰胺酶菌种DSM40587进行突变和筛选。作为原始菌株或者出发菌株，本专利技术诱变所用的茂原链霉菌DSM40587在文献(张莉丽，等。发酵条件对茂原链霉菌谷氨酰胺转胺酶产量的影响。中国乳品工业，2014(07)，pp16-19)中已报道过，上海东之汇生物科技有限公司保藏有该菌株，任何单位和个人都可以获得该菌株用于验证本专利技术，但未经上海东之汇生物科技有限公司允许不得用作其他用途，包括科学研究和教学。众所周知，诱变育种是微生物改良常用的和有效的手段，人工诱变改良菌种的方法至今仍不失为选育高产菌的有效手段，目前使用的诱变剂基本上可分为物理诱变因子(如紫外线、X射线、快中子、常压室温等离子体(ARTP)等)、化学诱变剂(如氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍等)、生物诱变因子(如噬菌体)以及复合诱变四大类，它们都能够提高生物体突变频率，同时又造成生物体的大量死亡。专利技术人采用紫外线诱变形式对出发菌DS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转谷氨酰胺酶生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020147或者CCTCC NO:M 2020148。/n

【技术特征摘要】
1.一种转谷氨酰胺酶生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2020147或者CCTCCNO:M2020148。


2.如权利要求1所述转谷氨酰胺酶生产菌用于生产转谷氨酰胺酶的应用。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过如权利要求1所述转谷氨酰胺酶生产菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱源，
申请(专利权)人：上海东之汇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31