干细胞冻存保护剂、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供一种干细胞冻存保护剂，以干细胞冻存保护剂总量为基准计，所述干细胞冻存保护剂包含：甘油体积分数为10％‑30％；海藻糖0.25mol/L‑1.5mol/L；溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液。本发明专利技术的干细胞冻存保护剂，是一种具有有效低温保存干细胞活性和功能的冷冻保护剂，高效且无毒无异种抗原，具有更高的生物安全性和临床应用可能性；不使用任何高分子聚合物及生物毒性物质，使用试剂均无细胞毒性，并且易洗脱；本发明专利技术无任何异种来源的血制品，无异种抗原，发生超敏反应的可能性较低；发明专利技术较现有的细胞冻存保护剂成本较低，大剂量应用的可能性大；操作方便，易于推广。

【技术实现步骤摘要】
干细胞冻存保护剂、制备方法及应用
本专利技术涉及医疗领域，特别是涉及一种干细胞冻存保护剂、制备方法及应用。
技术介绍
干细胞具有分化为成脂、成骨以及成软骨等中胚层来源细胞的潜能，同时还能通过旁分泌信号传导机制分泌刺激组织再生的生长因子和细胞因子等生物活性分子，为软组织填充、糖尿病、肝损伤、难愈性创面及自身免疫性疾病提供替代治疗，甚至可以进行同种异体移植治疗，已成为医学界最前沿、最热门的研究领域之一。如能长期保存干细胞，即可很好的解决手术时机的限制并可为以后的临床应用提供具有稳定遗传特性且充足数量的细胞。冷冻保存是长期保存的主要形式，然而冷冻保存的过程中，细胞内冰晶形成等过程会对细胞形成冷冻损伤，对干细胞活性和功能有明显影响。冷冻保护剂的加入可保护细胞免受低温冻存中的冷冻损伤，能更好的保存细胞的生物性能。目前针对干细胞冻存经典保护剂为10％二甲基亚砜(DMSO)+90％胎牛血清(FBS)，其中二甲基亚砜在常温下为细胞毒性物质，在临床使用时难以保证其冻存后能够被洗脱到无存留，而胎牛血清含异种抗原，有造成人畜共患病及导致免疫反应等风险，因此两者均可能对患者造成不良影响。其他一些保护剂使用方法复杂或成本高昂，不适于推广和应用。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种干细胞冻存保护剂、制备方法及应用，用于解决现有技术中冻存保护剂毒性高、冻存效果差的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种干细胞冻存保护剂，以干细胞冻存保护剂总量为基准计，所述干细胞冻存保护剂包含：甘油体积分数为10％-30％；海藻糖0.25mol/L-1.5mol/L；溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液。本专利技术第二方面提供前述干细胞冻存保护剂用于干细胞冻存的用途。本专利技术第三方面提供一种干细胞冻存保护剂的制备方法，包括如下步骤：1)将海藻糖加入到生理盐水或磷酸盐缓冲液中，配制海藻糖溶液；2)以甘油为溶质，海藻糖溶液为溶剂配成干细胞冻存保护剂。本专利技术第四方面提供一种干细胞冻存的方法，包括如下步骤：1)将前述的干细胞冻存保护剂与干细胞以体积比1:1混合，得到混合物1；2)将混合物1置于程序降温盒中，于-80摄氏度下程序降温；3)将步骤2)得到的混合物1置于液氮中冻存，得到冻存的干细胞。如上所述，本专利技术的干细胞冻存保护剂、制备方法及应用，具有以下有益效果：本专利技术的干细胞冻存保护剂，具有有效低温保存干细胞活性和功能的冷冻保护剂，高效且无毒无异种抗原，具有更高的生物安全性和临床应用可能性；不使用任何高分子聚合物及生物毒性物质，使用试剂均无细胞毒性，并且易洗脱；本专利技术无任何异种来源的血制品，无异种抗原，发生超敏反应的可能性较低；专利技术较现有的细胞冻存保护剂成本较低，大剂量应用的可能性大；操作方便，易于推广。附图说明图1：脂肪干细胞在不同冷冻保护剂保护下-196冻存180天后，复苏，通过台盼蓝检测细胞活性。图2：脂肪干细胞在不同冷冻保护剂保护下-196冻存180天后，复苏，通过CCK8检测细胞的增值能力。图3：脂肪干细胞在不同冷冻保护剂保护下-196冻存180天后，复苏，通过划痕实验检测细胞迁移能力。图4：脂肪干细胞在不同冷冻保护剂保护下-196冻存180天后，复苏，检测细胞的三向分化能力。具体实施方式现有技术中，暂无明确可临床应用的脂肪干细胞冻存保护剂，仅少数低毒性配方在实验方案中使用，如2017年WangC等人使用97％人类血小板裂解物(PL)+3％DMSO冻存脂肪干细胞；2018年SeahP等人使用9％人血白蛋白/90％人血清/90％无血清培养基+10％DMSO冻存脂肪干细胞。现有的冻存保护剂具有以下缺点：①冻存剂渗透性不佳，细胞冻存保护效果不佳。②仍存在生物毒性，如仍旧使用高分子聚合物或DMSO，临床应用时无法保证洗脱干净。③使用胎牛血清等含异种抗原的血制品，可能引发超敏反应。④使用人血白蛋白等血制品生物制剂，成本较高昂，存在血源性疾病风险。⑤技术复杂，成本高昂，难以推广，使用如海藻酸钠等纳米材料包裹细胞。以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围；在本专利技术说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。除非另外说明，本专利技术中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。本专利技术一实施例为干细胞冻存保护剂，以干细胞冻存保护剂总量为基准计，所述干细胞冻存保护剂包含：甘油体积分数为10％-30％；海藻糖0.25mol/L-1.5mol/L溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液。通过两类具有不同作用的保护剂联合使用可通过以下2方面提高细胞保护效率：(1)利用渗透性保护剂(甘油)促进非渗透性保护剂(海藻糖)转移进入细胞，提高非渗透性保护剂作用效率；(2)渗透性保护剂和非渗透性保护剂作用互补。可选的，所述干细胞冻存保护剂中，甘油的体积分数可以为10％-15％，15％-20％，20％-25％，25％-30％。可选的，所述干细胞冻存保护剂中，海藻糖的浓度可以为0.25mol/L-0.35mol/L，0.35mol/L-0.45mol/L，0.45mol/L-0.55mol/L，0.55mol/L-0.65mol/L，0.65mol/L-0.75mol/L，0.75mol/L-0.85mol/L，0.85mol/L-0.95mol/L，0.95mol/L-1.0mol/L，1.0mol/L-1.1mol/L，1.1mol/L-1.2mol/L，1.2mol/L-1.3mol/L，1.3mol/L-1.4mol/L，1.4mol/L-1.5mol/L。生理盐水为浓度0.9％的氯化钠溶液。所述磷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞冻存保护剂，其特征在于，以干细胞冻存保护剂总量为基准计，所述干细胞冻存保护剂包含：/n甘油 体积分数为10％-30％；/n海藻糖 0.25mol/L-1.5mol/L；/n溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液。/n

【技术特征摘要】
1.一种干细胞冻存保护剂，其特征在于，以干细胞冻存保护剂总量为基准计，所述干细胞冻存保护剂包含：
甘油体积分数为10％-30％；
海藻糖0.25mol/L-1.5mol/L；
溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液。


2.如权利要求1所述的干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述干细胞冻存保护剂不包含生物毒性物质、高分子聚合物、异种抗原或异种来源的血制品。


3.如权利要求1所述的干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述干细胞冻存保护剂能使干细胞在-196℃条件下能稳定存储至少180天。


4.如权利要求1所述的干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述干细胞选自脂肪干细胞。


5.如权利要求1-4任一所述的干细胞冻存保护剂用于干细胞冻存的用途。


6.一种干细胞冻存保护剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将海藻糖加入到生理盐水或磷酸盐缓冲液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：李青峰，周双白，张天钰，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31