建立检测微卫星不稳定的基线的方法、装置及应用制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种建立检测微卫星不稳定的基线的方法、装置及应用。该方法包括以下步骤：S1，针对待测样本的测序数据在人类参考基因组上所对应的区域，搜索区域内微卫星位点中单碱基重复位点；S2，统计多个阴性样本白细胞测序数据在单碱基重复位点上不同重复类型的短序列覆盖量，舍去不同重复类型小于5及覆盖深度小于30的位点，得到候选MS位点，利用候选MS位点的短序列覆盖量除以样本总的短序列数量算出标准化短序列覆盖量，所有候选MS位点上不同重复类型的标准化短序列覆盖量即为候选MS位点基线。应用本发明专利技术的技术方案，在保证检测敏感性的同时，降低检测成本。

【技术实现步骤摘要】
建立检测微卫星不稳定的基线的方法、装置及应用
本专利技术涉及生物信息学
，具体而言，涉及一种建立检测微卫星不稳定的基线的方法、装置及应用。
技术介绍
微卫星(Microsatellite)是遍布于人类基因组中的短串联重复序列，有单核苷酸、多核苷酸或高位核苷酸的重复，重复次数10～50次。与正常细胞相比，肿瘤细胞内的微卫星由于重复单位的插入或缺失导致微卫星长度的改变，就叫做微卫星不稳定性(MicrosatelliteInstability,MSI)。人类基因组中包含数万个微卫星位点，由于它们一般处于可积累中性突变的非编码DNA区域，在人群中呈现高度多态性。大量研究表明，MSI是由错配修复(MMR)基因发生缺陷引起的，MSI现象与1993年被Jacobs等人在结直肠癌中首次发现，与癌症发生有关，可用于癌症检测。通过观察12种不同类型的癌症，DungLe等人发现MMR缺陷的癌症对含有抗PD-1抗体的免疫检查点阻断剂的治疗敏感。86例晚期具有MSI缺陷的癌症患者参与了KEYNOTE-016研究，并使用抗PD-1抗体药进行治疗，客观缓解率高达54％，疾病控制率达72％。研究者对三名患者的T细胞受体基因的CDR3区域进行了深度测序发现，在治疗前，克隆体在外周血中出现的频率非常低(通常无法检测到)，但开始治疗后，克隆体数量迅速增加。对于其中一名患者，他们继续对T细胞克隆与突变肽结合能力进行功能表征。测试了患者治疗后的外周血对15种最常见的突变新抗原的反应性，发现一些T细胞克隆在治疗后扩大，对这些突变相关新抗原具有特异性。这项研究意义重大，因为它为MMR缺陷癌症中大量突变新抗原对免疫检查点阻断剂治疗敏感的假设提供了支持数据。在此项研究及其他研究结果的支持下，2017年，美国食品药品监督管理局(FDA)首次批准PD-1抗体药物Keytruda用于遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)治疗高频微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)的实体瘤患者。这是首个不依照肿瘤来源，而是依照分子标记物进行区分的抗肿瘤疗法，具有里程碑式的意义。当肿瘤细胞中存在MMR基因功能缺失(Mis-MatchRepairdeficiency,dMMR)时，肿瘤细胞失去对DNA复制错误的修复能力，肿瘤细胞内将积累大量突变，就会伴随出现MSI特征。研究表明，肿瘤细胞携带的突变越多，能被患者自身免疫系统特异性识别的新生抗原就越多，免疫系统特异性杀伤肿瘤细胞的概率就越大。但往往免疫系统没有攻击肿瘤细胞的原因在于肿瘤细胞通过PD-1/PD-L1这条信号通路抑制了免疫T细胞的杀伤作用。Keytruda是一种PD-1单抗，能够阻断PD-1/PD-L1这条信号通路，从而解除肿瘤细胞对免疫T细胞的抑制作用，若同时肿瘤细胞表面又有大量能被T细胞识别的新生抗原，T细胞就能顺利杀死肿瘤细胞，达到较好的治疗效果。因此理论上那些具有dMMR/MSI-H型特征的实体瘤患者更能在Keytruda解除免疫抑制作用后获益。所以通过MSI检测区分出MSI-H实体瘤患者额，具有重大的临床意义。现有检测MSI的方法有两种，分别为PCR技术及免疫组化(ICH)技术。PCR技术检测方法主要是对石蜡切片进行人工显微镜切割提取DNA，以一些微卫星点为标记指导合成引物进行多重荧光PCR对检测位点进行扩增，再通过毛细管电泳对扩增产物进行检测，并利用专业软件对两种组织来源检测结果进行比对分析。最常用的检测位点由美国国家癌症研究所(NCI)推荐的3个双核苷酸(D2S123、D5S346和D17S250)和2个单核苷酸(BAT-25和BAT-26)构成。后有研究发现将这些标记物作为错配修复(dMMR)缺陷的功能指标，并基于这些指标将肿瘤分为MSI-high、MSI-low和MSI-stable，在检测MSI-high时，二核苷酸重复序列比单核苷酸重复序列更不敏感，因此，更新为包含5个单核苷酸重复序列(BAT-25、-26，MONO-27，NR-21、-24)。主要的DNAMMR基因包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、PMS1。ICH方法通常检测这四个基因，并依赖于这四个基因的蛋白表达水平。这两种MSI传统检测方法可能存在误判。有研究人员研究了这两种检测方法的准确性，该研究对38例参加CheckMate-142和KEYNOTE-164临床试验的患者进行免疫治疗疗效的验证。同时对来自法国6家医院MSI/dMMR的患者进行了检测结果的验证。通过ICH重新评估MMR，并且通过PCR和HT17assay的方法重新评估微卫星状态。在38例患者中，有5例发生原发耐药。经重新验证后，5例耐药患者中有3例(60％)MSI和dMMR状态发生误判：2例仅经一种方法检测；1例ICH和PCR结果不一致。来自法国6家医院被评估为dMMR或MSI的93例患者进行了检测结果的验证，其中有9例(10％)存在MSI假阳性的误判，其中6例仅通过一种方法检测，3例ICH和PCR结果不一致。基于NextGenerationSequencing(NGS)的MSI检测方法的主要优点是，可以评估数百个甚至数千个MSI位点，而不是局限于传统的基于PCR评估方法中的5位点。此外，使用独立的检测方法来评估MSI对每个癌症患者的效率都很低，因为只有5％的癌症MSI水平较高，而NGS允许MSI检测作为更全面分析的一部分，包括评估用于靶向治疗的驱动突变和肿瘤突变负荷。利用靶向测序技术对配对的肿瘤-正常双样本进行MSI检测的方法越来越多，然而由于回顾性样本缺乏正常对照而不能成功检测。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种建立检测微卫星不稳定的基线的方法、装置及应用，以解决现有技术中由于回顾性样本缺乏正常对照而不能成功检测的技术问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种建立检测微卫星不稳定的基线的方法。该方法包括以下步骤：S1，针对待测样本的测序数据在人类参考基因组上所对应的区域，搜索区域内微卫星位点中单碱基重复位点；S2，统计多个阴性样本白细胞测序数据在单碱基重复位点上不同重复类型的短序列覆盖量，舍去不同重复类型小于5及覆盖深度小于30的位点，得到候选MS位点，利用候选MS位点的短序列覆盖量除以样本总的短序列数量算出标准化短序列覆盖量，所有候选MS位点上不同重复类型的标准化短序列覆盖量即为候选MS位点基线。进一步地，S1中微卫星位点的筛选标准为重复区覆盖范围为10bp～100bp，最大重复单元为5个碱基，人类参考基因组为人类参考基因组GRCh37/hg19。进一步地，建立检测微卫星不稳定的基线的方法还包括：使用验证过的样本作为训练集，对候选MS位点进行训练，统计所有训练样本在所有候选MS位点上不同单核苷酸重复类型的短序列覆盖量，舍去不同重复类型小于5及覆盖深度小于30的位点，利用候选MS位点的短序列覆盖量除以样本总的短序列数量算出标准化短序列覆盖量，应用决策树分类器算法筛选出归类于阳性样本的候选MS位点为优选MS位点，所有优选MS位点上不同重复类型的标准化短序列覆盖量即为优选MS位点基线。根据本专利技术的另一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种建立检测微卫星不稳定的基线的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1，针对待测样本的测序数据在人类参考基因组上所对应的区域，搜索所述区域内微卫星位点中单碱基重复位点；/nS2，统计多个阴性样本白细胞测序数据在所述单碱基重复位点上不同重复类型的短序列覆盖量，舍去不同重复类型小于5及覆盖深度小于30的位点，得到候选MS位点，利用所述候选MS位点的短序列覆盖量除以样本总的短序列数量算出标准化短序列覆盖量，所有所述候选MS位点上不同重复类型的标准化短序列覆盖量即为候选MS位点基线。/n

【技术特征摘要】
1.一种建立检测微卫星不稳定的基线的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，针对待测样本的测序数据在人类参考基因组上所对应的区域，搜索所述区域内微卫星位点中单碱基重复位点；
S2，统计多个阴性样本白细胞测序数据在所述单碱基重复位点上不同重复类型的短序列覆盖量，舍去不同重复类型小于5及覆盖深度小于30的位点，得到候选MS位点，利用所述候选MS位点的短序列覆盖量除以样本总的短序列数量算出标准化短序列覆盖量，所有所述候选MS位点上不同重复类型的标准化短序列覆盖量即为候选MS位点基线。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中微卫星位点的筛选标准为重复区覆盖范围为10bp～100bp，最大重复单元为5个碱基，所述人类参考基因组为人类参考基因组GRCh37/hg19。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述建立检测微卫星不稳定的基线的方法还包括：使用验证过的样本作为训练集，对所述候选MS位点进行训练，统计所有训练样本在所有所述候选MS位点上不同单核苷酸重复类型的短序列覆盖量，舍去不同重复类型小于5及覆盖深度小于30的位点，利用所述候选MS位点的短序列覆盖量除以样本总的短序列数量算出标准化短序列覆盖量，应用决策树分类器算法筛选出归类于阳性样本的候选MS位点为优选MS位点，所有所述优选MS位点上不同重复类型的标准化短序列覆盖量即为优选MS位点基线。


4.一种检测微卫星不稳定的方法，其特征在于，包括：
1)建立基线，采用权利要求1至3中任一项所述的方法建立检测微卫星不稳定的基线；
2)分析待测样本的测序数据，舍去所述候选MS位点或所述优选MS位点上不同重复类型小于5及覆盖深度小于30的位点，算出剩余候选MS位点或优选MS位点上的标准化短序列覆盖量，使用秩和检验比较每个候选MS位点或优选MS位点在所述候选MS位点基线或所述优选MS位点基线和待测样本中的差异，根据差异判断微卫星不稳定。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：计算具有不稳定性的微卫星位点在所有候选MS位点或优选MS位点中的比例，该比例大于60％即认为该样本具有微卫星不稳定性。


6.一种建立检测微卫星不稳定的基线的装置，其特征在于，包括：
检测位点筛选模块，设置为针对待测样本的测序数据在人类参考基因组上所对应的区域，搜索所述区域内微卫星位点中单碱基重复位点；
候选MS位点基线生成模块，设置为统计多个阴性样本白细胞测序数据在所述单碱基重复位点上不同重复类型的短...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐冰，张静波，单光宇，伍启熹，王建伟，刘倩，唐宇，
申请(专利权)人：北京优迅医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11