一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒及其应用，属于药物分析技术领域。针对抗凝血药物达比加群、利伐沙班和阿哌沙班，待测血浆样本经蛋白沉淀处理后，先利用超高效液相色谱将待测物质与血浆基质进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算待测物的含量。本发明专利技术的试剂盒灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，4.5 min之内可完成分离和检测，准确度和精密度基本满足要求。

【技术实现步骤摘要】
一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒及其应用
本专利技术属于药物分析
，具体涉及一种利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物的试剂盒及其应用。
技术介绍
治疗药物监测(TDM)是针对不同患者个体、量体裁衣式地制定给药方案的一种方法，通过定量测定血浆中药物浓度来进行患者个体的剂量滴定，以便获得最佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低毒副作用。LC-MS/MS的方法可以实现快速、高通量、准确的检测体内抗凝血药物浓度，为临床上实时监测体内抗凝血药物浓度，达到最佳的治疗效果，尽可能的减少不良反应的发生。达比加群(DBT)是一种强极性的两性化合物，不溶于有机溶剂，达比加群酯是DBT的前药，在体内可被转化为达比加群从而发挥抗凝作用。达比加群酯是一种人工合成的新型口服抗凝抑制剂，它能可逆地竞争性抑制凝血酶活性，属于非肽类凝血酶抑制剂，其口服后通过消化道迅速吸收，在血浆和肝脏内通过酯酶水解可以产生活性代谢产物达比加群，通过抑制凝血酶发挥抗凝活性。利伐沙班(RXB)和阿哌沙班(AXB)均属于选择性Ⅹa因子抑制剂，它不需要抗凝血酶Ⅲ参与，可直接拮抗游离和结合的Ⅹa因子，临床用于择期髋关节或膝关节置换术的成年患者，以预防静脉血栓形成。目前，已有文献报道采用HPLC-UV和LC-MS/MS法测定血浆中的药物含量。中国临床药理学杂志第35卷第10期2019年5月，题为“液质联用法同时测定人血浆中达比加群和利伐沙班的浓度”的文章使用同位素内标定量，且前处理简单，血浆样品200μL进行蛋白沉淀处理，定量下限为2ng/mL，运行时间为6min，进样量10μL。国外已报道同时测定这三种药的LC-MS/MS方法(Bioanalysis,2016,8(4),275-283)，虽然定量下限为1ng/mL，但采用固相萃取处理样本，操作繁琐，而且运行时间为10min。专利CN104730165B公开了一种利伐沙班的高效液相色谱检测方法，该专利技术分析时间8min，采用外标法定量，缺乏准确性。目前现有的方法存在操作步骤繁琐、血浆用量大、单个样品分析时间长、灵敏度低或使用外标法准确性差，检测项目单一等缺点。此外，由于临床样本极其珍贵，因此前处理样本量尽量要少，且进样量过大会严重污染仪器，增加仪器维护成本。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物的试剂盒，可大大简化现有方法，且便于实验室检测，可满足临床需要。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒，包括：流动相、校准品溶液、混合内标工作液和质控品；所述抗凝血药物包括达比加群(Dabigatran，DBT)、利伐沙班(Rivaroxaban，RXB)、阿哌沙班(Apixaban，AXB)；所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液、流动相B为甲酸甲醇溶液；所述校准品溶液包括系列浓度已知的由空白血浆配制的达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的混合溶液；所述混合内标工作液包括浓度已知的由乙腈溶液配制的达比加群-13C6、利伐沙班-d4和阿哌沙班-13C,d3的混合溶液；所述质控品包括浓度已知的由空白血浆配制的达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的混合溶液。进一步地，所述试剂盒还包括蛋白沉淀剂。进一步地，所述蛋白沉淀剂为甲醇或乙腈中的一种或两种的混合液。进一步地，所述蛋白沉淀剂为乙腈。进一步地，所述流动相A为0.001％-0.01％甲酸水溶液，流动相B为0.001％～0.01％甲酸甲醇溶液。进一步地，所述流动相A为0.004％甲酸水溶液，流动相B为0.004％甲酸甲醇溶液。进一步地，所述校准品溶液包括七种浓度配比的混合液。进一步地，所述混合内标工作液中达比加群-13C6、利伐沙班-d4和阿哌沙班-13C,d3的浓度分别为：达比加群-13C650ng/mL、利伐沙班-d425ng/mL、阿哌沙班-13C,d350ng/mL。进一步地，所述质控品包括低、中、高三种浓度配比的混合液。上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物含量中的应用。有益效果：1、采用本专利技术的试剂盒检测血浆中抗凝血药物含量，前处理过程简单、灵敏度高、分析时间短、样本用量少，4.5min之内即可完成3种抗凝血药物的分离和检测；2、本专利技术的试剂盒采用同位素内标法进行定量，可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗凝血药物的定量分析，为临床上抗凝血药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。附图说明图1为实施例1中抗凝血药物的标准品提取离子流色谱图图2为实施例1中血浆中抗凝血药物的提取离子流色谱图。具体实施方式本专利技术提供了一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗凝血药物的试剂盒，所述抗凝血药物包括达比加群(Dabigatran，DBT)、利伐沙班(Rivaroxaban，RXB)和阿哌沙班(Apixaban，AXB)，上述抗凝血药物对应的同位素内标物分别为：达比加群-13C6(DBT-13C6)、利伐沙班-d4(RXB-d4)、阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)。所述的试剂盒包含如下试剂：(1)流动相：流动相A：水(含0.001％～0.01％甲酸)；流动相B：甲醇(含0.001％～0.01％甲酸)；(2)校准品溶液：将包含有20000ng/mLDBT、10000ng/mLRXB和20000ng/mLAXB的混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：DBT和AXB的浓度相同，依次为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；RXB的浓度依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；(3)混合内标工作液：包含有50ng/mLDBT-13C6、25ng/mLRXB-d4和50ng/mLAXB-13C,d3的混合内标工作液；(4)蛋白质沉淀剂；(5)质控品：含有抗凝血药物的空白血浆基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，QC(L)为中浓度质控用空白血浆稀释10倍；QC(M)为空白血浆稀释混合标准溶液500倍；QC(H)为空白血浆稀释混合标准溶液50倍。在一种优选方案中，上述流动相A为0.001％-0.01％甲酸水溶液，优选为0.004％甲酸-水溶液；流动相B为0.001％-0.01％甲酸甲醇溶液，优选为0.004％甲酸-甲醇溶液。在一种方案中，蛋白沉淀剂为甲醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括流动相、校准品溶液、混合内标工作液和质控品；/n所述抗凝血药物包括达比加群、利伐沙班和阿哌沙班；/n所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液、流动相B为甲酸甲醇溶液；/n所述校准品溶液包括系列浓度已知的由空白血浆配制的达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的混合溶液；/n所述混合内标工作液包括浓度已知的由乙腈溶液配制的达比加群-13C6、利伐沙班-d4和阿哌沙班-13C,d3的混合溶液；/n所述质控品包括浓度已知的由空白血浆配制的达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的混合溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括流动相、校准品溶液、混合内标工作液和质控品；
所述抗凝血药物包括达比加群、利伐沙班和阿哌沙班；
所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液、流动相B为甲酸甲醇溶液；
所述校准品溶液包括系列浓度已知的由空白血浆配制的达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的混合溶液；
所述混合内标工作液包括浓度已知的由乙腈溶液配制的达比加群-13C6、利伐沙班-d4和阿哌沙班-13C,d3的混合溶液；
所述质控品包括浓度已知的由空白血浆配制的达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的混合溶液。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括蛋白沉淀剂。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为甲醇或乙腈中的一种或两种的混合液。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为乙腈。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为0.001%-0.01%甲酸水溶液，流动相B为0.001%~0.01%甲酸甲醇溶液。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为0.004%甲酸水溶液，流动相B为0.004%甲酸甲醇溶液。


7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品溶液包括以下七种浓度配比的混合液：
混合液1：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群2ng/mL、利伐沙班1ng/mL、阿哌沙班2ng/mL；
混合液2：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班的浓度分别为：达比加群5ng/mL、利伐沙班2.5ng/mL、阿哌沙班5ng/mL；
混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：成晓亮，李美娟，
申请(专利权)人：南京品生医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32