一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法及其应用，属于代谢组学和化合物分析技术领域。本发明专利技术利用代谢组学方法非靶向的寻找差异性代谢物对蜂胶及蜂胶产品进行鉴别，分析对象为蜂胶产品中相对差异性大的物质，而不是绝对含量高的物质。利用超高效液相色谱串联高分辨质谱(UPLC‑Q Exactive)对不同产地、不同加工程度蜂胶产品进行分析，获得的原始数据结合多元变量统计分析方法探究不同产地、不同加工程度蜂胶产品之间代谢物的区别，从极小的代谢物水平解释不同蜂胶产品之间的差异，为蜂胶及其制品的规范使用提供理论基础。

【技术实现步骤摘要】
一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法及其应用
本专利技术属于代谢组学和化合物分析
，具体涉及一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法及其应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。蜂胶是蜜蜂从胶源植物的芽苞、树皮或树干上采集来的树脂类物质，并混入其上颌腺分泌物、蜂蜡和少量花粉反复加工而成的一种具有芳香气味的胶状混合物，多为黄褐色、青褐色，是较为珍贵的蜜蜂产品。据研究，蜂胶中含有300多种化合物，包括酚酸及其酯、黄酮类化合物(黄酮类和查尔酮)、萜烯类、芳香醛类、醇类、脂肪酸、甾体类、氨基酸、木脂素和糖，萜类化合物和矿物元素，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗辐射、抑菌等生物学活性，目前已广泛应用于食品、制药等领域。蜂胶的生物活性成分主要依赖于采集地胶源植物的树脂成分，采集地周围的季节、地理特征及植被类型都会对蜂胶品质产生影响。Magdalena等利用UPLC/PDA/TQD对三个季节采集的蜂胶提取物的化学成分进行分析，结果表明春季采集的样品中黄酮和酚酸的测定值之和最高，秋季采集的样品中测定值之和最低，酚类物质的浓度不同季节采集的样品相似但差别不大。蜂胶中酚类化合物的多样性与蜜蜂采取的植物树脂的复杂性有关，也与所采取的植物周围的植被的组合种类有关，特别是在植物多样性很强的地方。尽管目前对蜂胶进行大量研究，但其确切组成在很大程度上尚不清楚。因其化学成分具有明显的地域性，对于某一产地的蜂胶的研究结果往往不适用于其他产地，要想实现对蜂胶品质的控制，必须要对不同产地的蜂胶成分进行研究。目前蜂胶类型依据胶源植物的不同分为杨树型蜂胶、巴西绿蜂胶(酒神菊属型Baccharis)、桦树型蜂胶、桉树型蜂胶(土耳其)、太平洋型(血桐属型MacarangaThou)蜂胶、地中海蜂胶、克鲁西亚型蜂胶和红蜂胶七大类。其中杨树型蜂胶的胶源植物为杨属植物，广泛分布于亚洲、欧洲、北美和新西兰等地，其主要的生物活性物质为黄酮类、黄烷酮类、酚类物质肉桂酸及其衍生物等，我国蜂胶的植物来源主要以杨属和其杂交属的芽苞分泌物为主，属于杨树型蜂胶，但近代引入我国的蜜蜂可能还没有适应采集我国本土杨树品种的树脂，如毛白杨、钻天杨等，主要采集欧洲黑杨及其杂交品种——加拿大杨的树脂。国内外对蜂胶的研究多采用气相色谱法、液相色谱法、红外光谱法、电子鼻法、核磁指纹图谱法或与各技术联用以及对单一物质鉴别法如水杨苷、叶绿素等，但专利技术人发现，其仍存在一定的局限性，比如GC只能分析蜂胶中的挥发性物质如酚酸等；HPLC可分析蜂胶中的高沸点和热不稳定化合物，但存在分离度不够、只检测具有紫外吸收特性的成分、流动相消耗量大、分析时间长等缺点；电子鼻虽响应时间短但检测结果易受环境因素的影响；特征物质鉴别如叶绿素、水杨苷等的单一标准无法对蜂胶进行精确鉴定，需要辅助抗氧化活性等指标，且大多并不适用于生物活性成分相差较小的蜂胶质控。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术目的在于提供一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法及其应用。本专利技术利用代谢组学方法非靶向的寻找差异性代谢物对蜂胶及蜂胶产品进行鉴别，分析对象为蜂胶产品中相对差异性大的物质，而不是绝对含量高的物质。利用超高效液相色谱串联高分辨质谱(UPLC-QExactive)对不同产地、不同加工程度蜂胶产品进行分析，获得的原始数据结合多元变量统计分析方法探究不同产地、不同加工程度蜂胶产品之间代谢物的区别，从极小的代谢物水平解释不同蜂胶产品之间的差异，为蜂胶及其制品的规范使用提供一定的理论基础，基于上述研究结果，从而完成本专利技术。为了解决以上技术问题，本专利技术的技术方案为：本专利技术的第一方面，提供一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法，所述方法包括：将待测蜂胶产品样品采用有机溶剂进行前处理后，使用超高效液相色谱串联高分辨质谱技术实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到待测蜂胶产品样品的UPLC-QExactive原始数据进行非靶向筛选，应用多元统计分析方法主成分分析(PCA)模型对不同蜂胶产品差异性代谢物进行鉴定和分析。其中，所述蜂胶产品包括不同产地和/或不同加工程度的蜂胶；所述产地包括但不限于山东、四川和河北；所述不同加工程度的蜂胶包括但不限于蜂胶原胶和蜂胶胶囊。本专利技术的第二个方面，提供上述分析方法在如下1)-6)中任意一种或多种的应用：1)蜂胶产品产地溯源；2)蜂胶产品胶原植物分析；3)蜂胶产品的合理使用；4)蜂胶产品的质量控制；5)蜂胶产品的品质评价；6)蜂胶产品的鉴定。上述一个或多个技术方案的有益技术效果：(1)上述技术方案基于UPLC-QExactive技术结合代谢组学采用非靶向筛选方法，能够检测到不同蜂胶产品中的低分子量和相对含量较少的代谢物，同时也大大缩短了检测分析时间。(2)上述技术方案对样品前处理较为简易，同时通过优化提取试剂，从而可以较为完整保留蜂胶中化合物，为后续分离鉴定奠定基础。(3)采用本专利技术技术方案可以有效筛选定性出的显著差异性的代谢物，即这些代谢物虽然不是在蜂胶中绝对含量高的物质，但确是对差异性贡献较大的物质，从而可以在极微量的代谢物水平解释不同蜂胶样品的差异，从而为蜂胶产地溯源和蜂胶产品的合理使用等提供了数据支撑，因此具有良好的实际应用之价值。说明书附图为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1中不同省份蜂胶的多元统计分析；其中，A,PCA得分图；B，PLS-DA得分图；C，PLS-DA得分图；D，OPLS-DA置信检验结果。图2为本专利技术实施例1中山东和四川省蜂胶的多元统计分析；其中，A,PCA得分图；B，PLS-DA得分图；C，PLS-DA得分图；D，OPLS-DA置信检验结果。图3为本专利技术实施例1中四川和河北省蜂胶的多元统计分析；其中，A,PCA得分图；B，PLS-DA得分图。图4为本专利技术实施例1中山东和河北省蜂胶的多元统计分析；其中，A，PCA得分图；B，PLS-DA得分：C，OPLS-DA得分图；D，OPLS-DA置信检验结果。图5为本专利技术实施例1中蜂胶原胶与网购蜂胶的多元统计分析；其中，A,PCA得分图；B，PLS-DA得分图；C，PLS-DA得分图；D，OPLS-DA置信检验结果。图6为本专利技术实施例1中蜂胶原胶与蜂胶胶囊的多元统计分析；其中，A，PCA得分图；B，PLS-DA得分图；C，PLS-DA得分图；D，OPLS-DA置信检验结果。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法，其特征在于，所述方法包括：将待测蜂胶产品样品采用有机溶剂进行前处理后，使用超高效液相色谱串联高分辨质谱技术实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到待测蜂胶产品样品的UPLC-QExactive原始数据进行非靶向筛选，应用多元统计分析方法主成分分析模型对不同蜂胶产品差异性代谢物进行鉴定和分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种针对不同蜂胶产品差异性代谢物的分析方法，其特征在于，所述方法包括：将待测蜂胶产品样品采用有机溶剂进行前处理后，使用超高效液相色谱串联高分辨质谱技术实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到待测蜂胶产品样品的UPLC-QExactive原始数据进行非靶向筛选，应用多元统计分析方法主成分分析模型对不同蜂胶产品差异性代谢物进行鉴定和分析。


2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述蜂胶产品包括不同产地和/或不同加工程度的蜂胶；
所述产地包括山东、四川和河北；
所述不同加工程度的蜂胶包括蜂胶原胶和蜂胶胶囊。


3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，样品前处理使用的有机溶剂包括甲醇和乙醇；
优选的，所用甲醇体积分数包括25～100％；所用乙醇体积分数包括25～100％；
最优选的，所述有机溶剂是体积分数95％的甲醇溶液。


4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述前处理过程具体方法包括：将待测蜂胶产品样品加入有机溶剂，超声、离心后得上清液，稀释过滤后得待测样品液，进行上机检测。


5.如权利要求4所述的分析方法，其特征在于，
蜂胶产品与有机溶剂的质量体积比为1g：30～50mL；优选为1g：40mL；
超声时间为10～60min，优选30min；
离心条件：低温条件下6000～12000rpm离心4～8min，优选4℃条件下8000rpm离心5min；
过滤采用有机滤膜进行，所述有机滤膜的孔径为0.20～0.25μm，优选0.22μm。


6.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，色谱条件包括：色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(2.1x50mm，1.7μm)，流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)，负谱条件下进行梯度洗脱；柱温为25℃，流速为0.3mL/min，进样量为3μL；
优选的，梯度洗脱具体程序为：0-2min1％A，2-3.25min1％-5％A，3.25-4.25min5％A，2.25-7.75min5％-55％A，7.75-9.75min55％-90％A，9.75-11.75min90％A，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿越，郐婉宁，李阳，王骏，薛霞，宿书芳，赵发，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37