用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它株的DNA片段、引物及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一段用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段，基于该特异性片段及其上下游序列，设计了三条引物，在以待测样本基因组为模板的PCR反应中，如果扩增出145bp和251bp的两条条带，说明检测样品中含有布鲁氏菌S2或019菌株；如果扩增出276bp大小的条带，说明检测样品含有除S2和019之外的其它布鲁氏菌；如果扩增出145bp、251bp和276bp的三条条带，说明检测样品中含有布鲁氏菌S2/019菌株和其它布鲁氏菌；如果没有出现上述情况，说明检测样品中不含有布鲁氏菌，被检动物无布鲁氏菌感染。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它株的DNA片段、引物及其检测方法
本专利技术涉及病原检测
，具体涉及一段用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段、一套特异性引物及其相应的PCR检测方法。
技术介绍
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜兽共患传染病，广泛分布于世界各地，不仅影响畜牧业的健康发展，而且危害人类健康。近年来发病率呈现逐年上升趋势。我国动物布病防控的主要策略是检疫与净化。我国使用的疫苗株主要是A19疫苗株和S2疫苗株，以前还曾使用过羊种M5-90疫苗株，由于毒力问题现在暂时不再使用。S2疫苗株的毒力比A19和Rev.1弱，对猪、牛、羊均能产生良好的免疫，其突出的优点还在于通过口服方式免疫怀孕母畜不会引起流产，目前在牛、羊免疫中经常使用。但它会在抗体的诊断中对布鲁氏菌野毒感染造成干扰，不能对自然感染和疫苗免疫动物进行抗体的鉴别诊断，这样在免疫养殖场就不能采用抗体检测的方法进行野毒感染动物的鉴定。要实行布鲁氏菌病检疫、扑杀、净化的防控规程，就必须从病原学方面对它们进行鉴别。现已有多种检测布鲁氏菌的检测方法，但这些方法普遍存在着操作复杂、费时、费用高的问题，不便于快速检验以指导临床。同时这些检测方法往往不能将布鲁氏菌S2疫苗株和其它菌株进行区分，因此，会出现将携带S2疫苗的动物作为野毒感染动物进行淘汰的错误结果，造成比较严重的经济损失。
技术实现思路
利用分子生物学方法，依据S2疫苗株与其它布鲁氏菌菌株基因组之间的差异碱基序列，设计特异性的引物，通过PCR等方法实现布鲁氏菌S2株和其它布鲁氏菌菌株的鉴别检测，为更好地进行布鲁氏病免疫、检测、淘汰的防控措施提供技术保障。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一段用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段，所述特异性DNA片段的核苷酸序列为SEQIDNo.1：TCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA。本专利技术还提供一种用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段的应用，所述特异性DNA片段用于检测和区分布鲁氏菌S2/019和其它布鲁氏菌菌株。一套鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的PCR引物，包括上游引物SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和下游引物SEQIDNo.4，分别命名为BF、S2/019F和BR，正向引物BF：5'-ATGCTTGGCGATCTCGGC-3'；正向引物S2/019F：5'-TCCAAGGTCGGCTACGAACAGC-3'；反向引物BR：5'-CTCCTTATTAGCGGACGCTCCC-3'本专利技术还提供一种鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的PCR检测方法，包括以下操作步骤：(1)提取待测样本的基因组；(2)以提取的样本基因组为模板，加入到含有反应液和聚合酶的反应体系的反应管中，进行PCR扩增；(3)取5ul扩增后的产物，加入至2％琼脂糖凝胶的加样孔内进行电泳检测，再在紫外灯下观察，如果扩增出145bp和251bp的两条条带，说明检测样品中含有布鲁氏菌S2或019菌株；如果扩增出276bp大小的条带，说明检测样品含有除S2和019之外的其它布鲁氏菌；如果扩增出145bp、251bp和276bp的三条条带，说明检测样品中含有布鲁氏菌S2/019菌株和其它布鲁氏菌；如果没有出现上述情况，说明检测样品中不含有布鲁氏菌，被检动物无布鲁氏菌感染。具体地，上述步骤(1)中，待测样本包括血液、奶样、组织样本、气溶胶样本中的任意一种。具体地，上述步骤(2)中，反应体系具体包括以下组份：具体地，上述步骤(2)中，PCR扩增反应的具体条件为：94℃进行预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，运行30个循环后反应结束。由以上的技术方案可知，本专利技术的有益效果是：1)本专利技术所述引物对具有较高的特异性，通过扩增-电泳检测，可有效的区分布鲁氏菌S2/019株、其它布鲁氏菌菌株及其它细菌，具有极高的准确率；2)在使用布鲁氏菌S2疫苗免疫的养殖场，进行布鲁氏菌野毒感染的检测及净化时，可以利用本专利技术对临床样品进行检测，排除感染布鲁氏菌S2疫苗株的样品，避免误以为是野毒感染从而淘汰导致的经济损失；3)在使用布鲁氏菌S2疫苗免疫的养殖场，配合本方法，免疫后仍可进行其它布鲁氏菌的检测和淘汰，有利于更好地进行布鲁氏的防控。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1一段用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段，所述特异性DNA片段的核苷酸序列为SEQIDNo.1：TCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA，见序列表，所述特异性DNA片段通过在线BLAST获得，在线BLAST所选片段时，在布鲁氏菌S2和019菌株中，该序列缺失，在其它的布鲁氏菌菌株中，该序列普遍存在。本实施例提供一种用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段的应用，所述特异性DNA片段用于检测和区分布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株。一套鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的PCR引物，包括上游引物SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和下游引物SEQIDNo.4，分别命名为BF、S2/019F和BR，正向引物BF：5'-ATGCTTGGCGATCTCGGC-3'；正向引物S2/019F：5'-TCCAAGGTCGGCTACGAACAGC-3'；反向引物BR：5'-CTCCTTATTAGCGGACGCTCCC-3'所述引物对具有较高的特异性，通过扩增-电泳检测，可有效的区分布鲁氏菌S2/019株、其它布鲁氏菌菌株及其它细菌，具有极高的准确率。实施例2一种鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的PCR检测方法，包括以下操作步骤：(1)棉签蘸取免疫过布鲁氏菌S2疫苗动物的流产分泌物，放入TRIzol中提取流产分泌物的基因组；(2)取1ul提取的流产分泌物的基因组作为模板，配制20ul反应体系，其中2×AceTaqMasterMix(DyePlus)10μl、20μM的正向引物BF1μl、20μM的反向引物S2/019F1μl、20μM的反向引物BR1μl、ddH2O6μl，将含上述反应体系的薄壁PCR管放入PCR仪，94℃进行预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，运行30个循环后反应结束；(3)取5ulPCR扩增反应的产物，加入至2％琼脂糖凝胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一段用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.1：TCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA。/n

【技术特征摘要】
1.一段用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段的核苷酸序列为SEQIDNo.1：TCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA。


2.一段用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的特异性DNA片段的应用，其特征在于，所述特异性DNA片段用于检测和区分布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株。


3.一套用于鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的PCR引物，包括上游引物SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和下游引物SEQIDNo.4，分别命名为BF、S2/019F和BR，
正向引物BF：5'-ATGCTTGGCGATCTCGGC-3'；
正向引物S2/019F：5'-TCCAAGGTCGGCTACGAACAGC-3'；
反向引物BR：5'-CTCCTTATTAGCGGACGCTCCC-3'。


4.一种鉴别布鲁氏菌S2/019株和其它布鲁氏菌菌株的PCR检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)提取待测样本的基因组；
(2)以提取的样本基因组为模板，加入到含有反应液和聚合酶的反应体系的反应管中，进行PCR扩增；
(3)取5ul...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宝山，陈泽良，沈国顺，刘金玲，韩小虎，张欢，杨博涵，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21