基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及其检测方法。所述的试剂盒用于检测急性淋巴细胞白血病相关的19种基因的多个外显子区域。所述的试剂盒包括检测相关基因突变的引物工作液，PCR混合液、PCR反应液、消化液、接头P5及接头P7。该试剂盒是基于多重PCR的靶向高通量测序技术进行的检测，具有高准确性、高灵敏度及高通量的优势，能快速高效对19种急性淋巴细胞白血病(ALL)相关基因进行标准化的定量检测。

【技术实现步骤摘要】
基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法
本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法。
技术介绍
白血病是由于造血干或前体细胞基因异常，导致细胞增殖、分化或凋亡异常，是一类具有高度异质性的恶性血疾病，其诊疗需要从形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学进行综合分析。白血病中最常见的分子生物学异常主要包括：基因突变、融合基因、基因表达，而基因突变中又以点突变、基因片段插入或缺失为主。急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤疾病。主要发生在儿童和成人中，其发病率在2至5岁之间达到高峰，主要临床表现为贫血、发热、感染、出血和器官浸润，患者的正常造血功能受到抑制，严重者累积淋巴、脑膜和肝脏等，可致患者死亡。根据白血病细胞的分子生物学特性和对治疗的反应，儿童急性淋巴细胞白血病的存活率已提高到约90％。然而，需要创新的分子生物学方法来进一步提高生存率，同时减少不利影响。婴儿和成人的急性淋巴细胞白血病(ALL)预后仍然很差。随着分子生物学测序技术的不断发展，大量与急性淋巴细胞白血病密切相关的分子生物学标记被发掘出来。白血病细胞DNA分析已经发现了新的亚微观结构遗传变化和序列变异，微观结构遗传变化主要包括：染色体数目和结构的易位、倒位、缺失和重复等；基因序列变异包括：点突变、基因片段插入或缺失等变异。它们影响着白血病的发生、定义新的疾病亚型以及影响治疗的反应性。2018年的国内专家共识---《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识》中指出基因突变的检测在血液肿瘤诊疗中的应用价值，明确了ALL的必要检测基因来辅助预后判断和治疗指导，并建议检测与ALL相关基因，为临床诊断分型、预后判断、治疗指导、微小残留病灶(MRD)监测以及克隆演变提供参考。利用高通量测序技术对基因组学的研究，极大地促进了我们对急性淋巴细胞白血病(ALL)分子发病机制的了解。ALL与大多数其他癌症相似，其特征是个体获得性突变，不同个体间出现基因突变的差异较大。本专利技术专利中涉及到的ALL中具有明确临床意义的19种基因按功能分类，可以分为染色质修饰的基因，如EP300；信号传导通路的基因，如FBXW7、FLT3、IL7R、JAK1、JAK2、JAK3、KRAS、NOTCH1、NRAS、PTEN和SH2B3；细胞代谢基因，如NT5C2；转录因子基因，如ETV6、GATA3、PAX5和RUNX1；抑癌基因，如WT1和TP53。这些基因发生突变如果在疾病的早期出现，通常与血液肿瘤的克隆演变相关；也可以随着年龄增长发生突变，伴随着造血克隆性扩张，这就增加了血液肿瘤的发生风险。此外，这些突变可能在治疗后持续存在，在血液学缓解期间会再次导致克隆扩增或伴随新克隆的出现，最终导致疾病复发。因此，对这些基因进行系统性的检测有助于ALL血液肿瘤微小残留病灶(MRD)监测和预后治疗指导。基于微小残留病灶(MRD)的基因突变负荷水平有助于血液肿瘤患者改善风险分层和缓解后治疗的选择，疾病等位基因的突变检测将指导新型分子靶向治疗的开发和应用。目前，分子生物学中基因突变检测的方法主要有一代测序(Sanger)、高通量测序技术(NGS)、实时荧光PCR(RQ-PCR)、数字PCR等，而高通量靶向测序技术主流的又以多重PCR的靶向测序和捕获探针的靶向测序为主。与一代(Sanger)测序技术相比，多重PCR的靶向测序技术具有更高的灵敏度，并且能够定量检测出基因突变负荷率；与捕获探针的靶向测序相比，多重PCR的靶向测序技术文库构建流程更加简单，能提供更经济、快速的测序方案，而实时荧光PCR(RQ-PCR)及数字PCR大多数是针对基因中已知突变位点的进行检测，并且实验过程中引物探针费用较高，做多基因突变筛查可行性较差。本专利技术专利中多重PCR的靶向测序技术是一种将多重PCR技术与高通量测序技术结合的一种靶向捕获测序技术，该技术是一种在同一PCR反应体系里加上多对引物，各对引物分别结合在模板的相应位置，同时扩增出多个核酸片段，再通过PCR反应将高通量测序所用的接头序列(index)引入到核酸片段的两侧，最终得到核酸文库进行高通量测序和生信流程分析来获取目标区域的序列信息，该技术具特异性强、实验周期短及DNA低起始量等优势，可用于血液、口腔拭子及FFPE等多种复杂样本。利用该技术对血液肿瘤相关基因的突变检测已经得到越来越广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于，克服现有的基因检测技术中存在的缺陷，而提供一种新的基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及检测方法，所要解决的技术问题是使其高效快速且易于操作，从而更加适于实用，且具有产业上的利用价值。本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。本专利技术的一个方面提供了一种基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，所示的试剂盒用于检测以下基因的突变：EP300第23-30号外显子、ETV6第1-8号外显子、FBXW7第9-12号外显子、FLT3第14-16、20号外显子、GATA3第4-5号外显子、IL7R第6号外显子、JAK1第14、17-19号外显子、JAK2第12、14、16、20、21号外显子、JAK3第11-16号外显子、KRAS第2-5号外显子、NOTCH1第26-28、34号外显子、NRAS第2-5号外显子、NT5C2第11、15号外显子、PAX5第1-10号外显子、PTEN第5-8号外显子、RUNX1第2-9号外显子、SH2B3第2号外显子、TP53第3-11号外显子、WT1第7-10号外显子；所示的试剂盒至少包括以下引物序列：在本专利技术的一些实施方案中，所述试剂盒包括独立包装的各组引物对，或包括配置好的含有各组引物对的PCR引物混合液。在本专利技术的一些实施方案中，所述试剂盒还包括引物工作液、PCR混合液、PCR反应液、消化液、接头P5及接头P7。在本专利技术的一些实施方案中，所述PCR混合液包含Buffer、dNTP、Mg2+；所述PCR反应液包括DNA聚合酶；所述消化液包括虾碱酶及外切酶。在本专利技术的一些实施方案中，所述试剂盒中的主要组成成分及其规格为：PCR混合液5μl，PCR反应液1μl，正向引物1μl，反向引物1μl，接头P51μl及接头P71μl。在本专利技术的一些实施方案中，所述试剂盒还包括阴性对照，所述的阴性对照是体积为2μl的RNase-FreeddH2O。在本专利技术的一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照，所述的阳性对照是含有ALL19种基因突变类型质粒的混合液。本专利技术的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。本专利技术的另一个方面还提供了一种用于急性淋巴白血病基因突变的检测方法，所述的方法包括以下步骤：(1)DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，/n所示的试剂盒用于检测以下基因的突变：EP300第23-30号外显子、ETV6第1-8号外显子、FBXW7第9-12号外显子、FLT3第14-16、20号外显子、GATA3第4-5号外显子、IL7R第6号外显子、JAK1第14、17-19号外显子、JAK2第12、14、16、20、21号外显子、JAK3第11-16号外显子、KRAS第2-5号外显子、NOTCH1第26-28、34号外显子、NRAS第2-5号外显子、NT5C2第11、15号外显子、PAX5第1-10号外显子、PTEN第5-8号外显子、RUNX1第2-9号外显子、SH2B3第2号外显子、TP53第3-11号外显子、WT1第7-10号外显子；/n所示的试剂盒至少包括以下引物序列：/n

【技术特征摘要】
1.一种基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，
所示的试剂盒用于检测以下基因的突变：EP300第23-30号外显子、ETV6第1-8号外显子、FBXW7第9-12号外显子、FLT3第14-16、20号外显子、GATA3第4-5号外显子、IL7R第6号外显子、JAK1第14、17-19号外显子、JAK2第12、14、16、20、21号外显子、JAK3第11-16号外显子、KRAS第2-5号外显子、NOTCH1第26-28、34号外显子、NRAS第2-5号外显子、NT5C2第11、15号外显子、PAX5第1-10号外显子、PTEN第5-8号外显子、RUNX1第2-9号外显子、SH2B3第2号外显子、TP53第3-11号外显子、WT1第7-10号外显子；
所示的试剂盒至少包括以下引物序列：




















2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括独立包装的各组引物对，或包括配置好的含有各组引物对的PCR引物混合液。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括引物工作液、PCR混合液、PCR反应液、消化液、接头P5及接头P7。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述PCR混合液包含Buffer、dNTP、Mg2+；所述PCR反应液包括DNA聚合酶；所述消化液包括虾碱酶及外切酶。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒中的主要组成成分及其规格为：PCR混合液5μl，PCR反应液1μl，正向引物1μl，反向引物1μl，P5接头1μl及P7接头1μl。


6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阴性对照，所述的阴性对照是体积为2μl的RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐春花，张鹏，邢宽，何志健，谢珍，夏统前，袁鸣，何贵伦，安雪茹，李平，
申请(专利权)人：南京实践医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32