宏基因组文库及建库方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种宏基因组文库及建库方法和应用，属于感染病原诊断技术领域。该方法包括以下步骤：S1：提取待测样本中的基因组核酸；S2：在片段化缓冲液体系中加入按照活性单位比1:6‑8的量加入基因组核酸和转座酶复合体，进行片段化和加接头反应；所述片段化缓冲液中包括数均分子量≥20,000的拥挤分子；S3：在S2步骤得到的溶液中直接加入引物和扩增试剂，对文库进行扩增；S4：对扩增后的文库进行纯化，即得。该方法适用于复杂核酸宏基因组条件，应用于临床感染病原诊断。该方法经过严格系统的优化后得出，不仅操作简便，耗时短，还能够提高文库复杂度，富集临床样本中mcfDNA，提高了检测灵敏度，增加了宏基因组对病原检测的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
宏基因组文库及建库方法和应用
本专利技术涉及感染病原诊断
，特别是涉及一种宏基因组文库及建库方法和应用。
技术介绍
宏基因组(mNGS)技术在发现和转化研究的诸多方面已逐渐成为一种被广泛采用的技术，在急难危重感染性疾病的病原诊断分析中有重要应用，能够对样本中的所有核酸进行无偏向测序，包括人源和微生物的核酸。在感染条件下，宿主免疫系统会发起对病原微生物的攻击，吞噬并片段化微生物的遗传物质。对于全身性感染疾病或中枢神经系统感染，多数情况下，并不能对病灶部位直接采样。非病灶部位的病原微生物丰度低，且主要以cfDNA形式存在。并且，在上述诊断检测环境下，常规的物理超声和内切酶片段化建库方法操作步骤繁琐，时间长。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种宏基因组文库及建库方法和应用，该建库方法针对复杂核酸宏基因组进行建库，不仅提高了病原检测的灵敏度，还缩短建库时间，达到24小时极致交付目标。一种宏基因组文库的建库方法，包括以下步骤：S1：提取待测样本中的基因组核酸；S2：在片段化缓冲液体系中按照活性单位比1:6-8的量加入基因组核酸和转座酶复合体，进行片段化和加接头反应；所述片段化缓冲液中包括数均分子量≥20,000的拥挤分子；S3：在S2步骤得到的溶液中直接加入引物和扩增试剂，对文库进行扩增；S4：对扩增后的文库进行纯化，即得。临床研究表明，cfDNA存在于病灶或非病灶部位的体液中，如脑脊液、血液、肺泡灌洗液、胸腹水、尿液等。血流感染患者血液中cfDNA的含量是正常人的5倍，cfDNA含量变化与传统的全身炎症反应标志物相关，可以作为预后的生物标志物，感染患者体液中增加的cfDNA包含mcfDNA，即检测感染患者体液中的cfDNA，可获得其中病原微生物的mcfDNA，辅助感染诊断。常规的NGS检测方法包括核酸提取、片段化、文库扩增和测序分析等四部分，在临床感染病原检测中，由于目标主要是针对微生物基因组和cfDNA片段进行测序和鉴定，即针对复杂核酸样本中的微量成分进行检测。本专利技术对比了常规物理超声片段法和转座酶法进行建库，按照常规方法，超声片段法具有检测灵敏度高的优势，但其具有步骤繁琐，耗时长的缺陷；而转座酶法虽然所耗费较短，但灵敏度较低。经过反复试验和探究，专利技术人发现，目前商业化转座酶方法建议对长度>500bp的片段进行建库，且转座酶的用量是针对长片段(>500bp)进行建库，而在感染病原检测中，待测样本中核酸的类型为人源和微生物的完整基因组或cfDNA；其中cfDNA包括宿主的cfDNA(humancfDNA，hcfDNA)和mcfDNA。hcfDNA为宿主细胞凋亡、溶解或坏死、细胞活性释放和巨噬细胞吞噬缺氧/坏死细胞及随后释放其DNA，片段大小集中于160bp-180bp。mcfDNA为免疫细胞对病原微生物吞噬后产生，片段长度在35bp-400bp不等，主峰为60bp-90bp。虽然不同症状临床样本的cfDNA长度不同，其变化取决于细胞凋亡和坏死的频率，以及细胞外不同的代谢过程，但其cfDNA长度均较短，小于500bp。进而限制了对mcfDNA的有效检测。本专利技术人还发现，转座酶建库方法中，转座酶和核酸的投入比例是决定核酸片段化范围的主要因素，在适当条件下，转座酶占比越高，获得的核酸片段越小。因此，基于转座酶的建库片段大小与转座酶和核酸投入量相关，而准确的投入量与核酸准确定量相关，核酸的准确定量与核酸的纯度相关。在此研究基础上，本专利技术人对建库实验参数进行了优化，使mcfDNA被有效富集。通过提高片段化缓冲液中拥挤剂的分子量，调整核酸分子与转座酶的比例，使临床样本中的mcfDNA片段被有效建库，提高临床感染病原检测的灵敏度。可以理解的，上述基因组核酸和转座酶复合体之间的用量以活性单位计，如按照活性单位计，理论上，与1份核酸片段文库反应需要2份转座酶复合体，则加入6份转座酶复合体。所述转座酶复合体指Tn5转座酶与19-bp转座子末端序列5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’的复合物。并且，在S3的文库扩增步骤中，可将S2步骤片段缓冲液体系中包含的拥挤分子也一起进入PCR体系，可显著提高文库扩增效率，缩减PCR的扩增延伸时长，降低长片段文库扩增的效率，提高短片段文库的富集效率，最终取得mcfDNA富集的效果。在其中一个实施例中，所述S1步骤中，所述基因组核酸纯度以吸光度比值计，达到OD260/OD280＝1.8-2.0。由于核酸的准确投入量与核酸纯度相关，为了确保有效建库，应严格控制投入核酸的纯度，本专利技术人发现，以Nanodrop仪器检测核酸吸光值OD，当OD260/OD280＝1.8-2.0方能符合要求。如不符合要求，则需对核酸进一步进行过柱纯化以达到后续建库要求。在其中一个实施例中，所述S1步骤中，采用下述方法提取待测样本中的基因组核酸：样本裂解：将待测样本加入裂解液中，混合均匀，离心后65℃-70℃孵育10min-15min，再次离心后冷却至室温；DNA纯化：将裂解后的裂解液全部转移到吸附柱中，离心弃去废液，加入缓冲液，离心去除结合在核酸上的蛋白质，加入缓冲液离心去除吸附在吸附柱上的离子，该步骤重复1-3次；DNA干燥：将吸附柱置于离心管中，10000-13000r/min离心3min，空甩，再将吸附柱晾干3min-5min；DNA溶解：在吸附柱中加入40-70μLTB缓冲液，放置3-6min，10000-13000r/min离心1-3min，收集DNA液体，即得。通过上述方法提取、纯化核酸，可提高核酸纯度，确保后续建库效果。在其中一个实施例中，所述S2步骤中，在55±1℃的条件下孵育10±2min进行片段化和加接头；所述拥挤分子选自：体积百分浓度为4-8％(优选6％)的PEG35000和/或PVPK25。拥挤分子是一类具有不同分子量的高聚物，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖70和聚蔗糖70等，生化反应缓冲体系中加入适量的拥挤剂可提高生化反应的效率，采用PEG和PVP作为拥挤分子，具有稳定，均分分散液体，提高酶促反应效率的优点。按照上述参数条件进行片段化和加接头，获得的文库片段主峰位于220bp处，且峰值高于其它条件。在其中一个实施例中，所述S3步骤中，所述扩增中温度条件为：72℃保持3min，98℃保持30sec，按照预定循环温度进行17±2个循环，72℃保持5min，所述循环温度为98℃保持15sec，60℃保持30sec，72℃保持30sec；所述引物工作浓度为10±1pM；所述S4步骤中，首先以0.8×PEG浓度缓冲液磁珠比例进行纯化，去除长片段，再以0.3×PEG浓度缓冲液磁珠比例进行纯化，去除残留接头。上述S3步骤中，将片段化缓冲液中包含的拥挤分子也一起带入PCR体系，可显著提高文库扩增效率，PCR扩增延伸时长可由3min变为30s，降低长片段文库扩增的效率，提高短片段文库的富集本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种宏基因组文库的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：提取待测样本中的基因组核酸；/nS2：在片段化缓冲液体系中按照活性单位比为1:6-8的量加入基因组核酸和转座酶复合体，进行片段化和加接头反应；所述片段化缓冲液中包括数均分子量≥20,000的拥挤分子；/nS3：在S2步骤得到的溶液中直接加入引物和扩增试剂，对文库进行扩增；/nS4：对扩增后的文库进行纯化，即得。/n

【技术特征摘要】
1.一种宏基因组文库的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：提取待测样本中的基因组核酸；
S2：在片段化缓冲液体系中按照活性单位比为1:6-8的量加入基因组核酸和转座酶复合体，进行片段化和加接头反应；所述片段化缓冲液中包括数均分子量≥20,000的拥挤分子；
S3：在S2步骤得到的溶液中直接加入引物和扩增试剂，对文库进行扩增；
S4：对扩增后的文库进行纯化，即得。


2.根据权利要求1所述的宏基因组文库的建库方法，其特征在于，所述S1步骤中，所述基因组核酸纯度以吸光度比值计，达到OD260/OD280＝1.8-2.0。


3.根据权利要求2所述的宏基因组文库的建库方法，其特征在于，所述S1步骤中，采用下述方法提取待测样本中的基因组核酸：
样本裂解：将待测样本加入裂解液中，混合均匀，离心后65℃-70℃孵育10-15min，再次离心后冷却至室温；
DNA纯化：将裂解后的裂解液全部转移到吸附柱中，离心弃去废液，加入缓冲液，离心去除结合在核酸上的蛋白质，加入缓冲液离心去除吸附在吸附柱上的离子，该步骤重复1-3次；
DNA干燥：将吸附柱置于离心管中，10000-13000r/min离心3-5min，空甩，再将吸附柱晾干3min-5min；
DNA溶解：在吸附柱中加入40-70μLTB缓冲液，放置3-6min，10000-13000r/min离心1-3min，收集DNA液体，即得。


4.根据权利要求1所述的宏基因组文库的建库方法，其特征在于，所述S2步骤中，在55±1℃的条件下孵育10±2min进行片段化和加接头；所述拥挤分子选自：体积百分浓度为4-8％的PEG35,000和/或PVPK25。


5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：许腾，曾伟奇，谢淑媚，秦璐，唐毅，李永军，王小锐，苏杭，
申请(专利权)人：广州微远基因科技有限公司，广州微远医疗器械有限公司，广州微远医学检验实验室有限公司，深圳微远医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44