一种利用巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸的方法。该方法以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载尿酸酶和过氧化氢酶，形成检测微单元，然后将负载酶的巯丙基琼脂糖球固定在试纸上形成尿酸检测试纸条，对尿酸进行检测。本发明专利技术制备简单，反应条件温和，可以实现随时随地快速高效检测，并且价格低廉，使用安全，对临床尿酸监测和疾病诊断有重要指导意义。

【技术实现步骤摘要】
一种利用巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸的方法
本专利技术涉及医学体外诊断
，具体涉及一种利用巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸的方法。
技术介绍
尿酸是嘌呤类化合物代谢的终产物，通过血浆从肝脏运输到肾脏，其中70％的尿酸通过尿液排出体外，其余经肠道、皮肤和头发排出体外。人体血浆中尿酸的正常值为：150-400μM，尿液中尿酸的正常值为：1.4-4.4mM，血浆中尿酸浓度大于420μM被称为高尿酸血症，低于150μM被称为低尿酸血症。高尿酸血症的产生，一方面是因为体内产生尿酸过多，一方面是因为多余的尿酸不能及时随尿液排出体外。尿酸在血浆中过多的积累将导致痛风的产生，尿酸以针状晶体的形式在关节和毛细血管中沉积，导致病人异常疼痛，严重的可引发高血压、糖尿病、输尿管结石、肾结石和其它肾脏疾病等，甚至危及生命。而低尿酸血症则与罕见遗传学代谢病有关(如威尔逊氏病、范科尼氏综合症等)。因此，尿酸的检测有助于评估痛风和监测肾功能衰竭患者的状态，以及部分代谢疾病的初步判断，对临床诊断和治疗有重要意义。目前，尿酸的检测分析方法有高效液相色谱法、荧光法、电化学方法和酶方法等。色谱法是最基本的检测方法，分离效果好，流动相简单，但样本处理过程繁琐，检测周期长，并且需要大型仪器，限制了其应用范围和场景。荧光法由于部分发色基团接近重合，可能存在相互干扰，导致数据不准确。电化学方法操作简单，成本低廉，灵敏度高，检出限低，但其要求的分离技术高，所需试剂和仪器昂贵难以普及。酶法分为紫外法和基于过氧化氢的尿酸间接测量法。紫外法的检测原理为：尿酸酶催化尿酸氧化还原反应后生成尿囊素和H2O2，通过检测293nm波长吸光度的变化来检测尿酸浓度，该方法反应时间长，吸光度的变化小，灵敏度低，现临床上一般作为备选方案。基于过氧化氢的尿酸间接测量法的原理为：尿酸在尿酸酶的催化下，被氧化生成过氧化氢，在过氧化氢酶的催化下能使发光底物发出光信号，该方法特异性好，准确度高，检测快速，但尿酸酶对反应条件高，无法回收继续利用，因此考虑采用酶固化的方法，将尿酸酶固定在基底上进行检测，可以提高酶的稳定性并且降低使用成本。中国专利CN110108656A【一种介孔有机硅中空纳米球固定尿酸酶检测尿酸的方法】介绍了其合成的一步生长诱导腐蚀法介孔有机硅中空纳米球，利用该纳米球固定尿酸酶对血清尿酸进行检测，是对尿酸检测体系进行的有益尝试和补充，但其以紫外分光光度计检测吸光度的变化，会受到共存的其他组份的干扰，从而影响测定结果，此外其吸光度变化小，灵敏度较低，需要进一步改进。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸的方法。目的在于提供一种能够简单快速实时检测尿酸的方法，方便检测者在家中自行检测，省去多次跑医院的繁琐流程。同时固定尿酸酶和过氧化氢酶的研究相对较少，过氧化氢酶的加入，不仅能够减轻尿酸氧化分解过程中产生的H2O2对酶的损伤，而且可以改变酶氧化的微环境，提高尿酸酶酶活力。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：首先，本专利技术提供一种尿酸检测试纸及其制备方法。本专利技术所提供的尿酸检测试纸通过包括如下步骤的方法制备得到：1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载尿酸酶和过氧化氢酶，得到负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，即检测微单元；2)将所述负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球(检测微单元)固定在试纸上，得到尿酸检测试纸。上述方法步骤1)中，所述负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球通过包括如下步骤的方法制备得到：(1)用水浸泡巯丙基琼脂糖球使其吸水膨胀，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与吸水膨胀后的巯丙基琼脂糖球反应，得到TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与尿酸酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与过氧化氢酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液；(2)向TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液，反应，得到负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球，向得到的负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液，反应，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球。其中，步骤(1)中，所述巯丙基琼脂糖球具体可为6B；所述巯丙基琼脂糖球为干燥的巯丙基琼脂糖球；尺寸范围可为45-165微米，平均尺寸大小可为90微米；所述水具体可为双蒸水；所述巯丙基琼脂糖球与水的配比可为：1ml:3ml-1ml:10ml；所述浸泡可为浸泡过夜；浸泡后巯丙基琼脂糖球的体积大概是干燥状态下体积的3倍；所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)为三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液；所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液中TCEP的浓度可为0.01-10mM，具体可为0.1mM或0.5mM，所用溶剂可为10mMTris-HCl(pH8.0)溶液；所述二硫苏糖醇(DTT)为二硫苏糖醇(DTT)溶液；所述二硫苏糖醇(DTT)溶液中DTT的浓度可为1-100mM，所用溶剂可为10mMTris-HCl(pH8.0)溶液；所述尿酸酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中尿酸酶的酶活为≥2units/mg；所用溶剂可为10mMPBS(pH7.4)，所述过氧化氢酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg；所用溶剂可为10mMPBS(PH7.4)；所述反应的温度均为室温，时间均为5min-2h小时，具体可为1小时。在进行(2)的操作前，还包括将所述TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用缓冲液洗涤，去除多余的TCEP或DTT；所述缓冲液具体可为10mMPBS(pH7.4)；步骤(2)中，TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液中的尿酸酶、TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液中的过氧化氢酶的配比依次可为：200μL：1-1000μg：1-1000μg；所述反应可为室温下旋转反应，所述反应的时间可为：0.2-3小时，具体可为1小时；步骤(2)中，在激活的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的尿酸酶反应后，还包括将所得体系用缓冲液洗涤，去除多余的尿酸酶，得到负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球的操作；所述缓冲液具体可为10mMPBS(pH7.4)；进一步包括：将负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶反应后的体系缓冲液洗涤，去除多余的过氧化氢酶，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的操作；所述缓冲液具体可为10m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备尿酸检测试纸的方法，包括如下步骤：/n1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载尿酸酶和过氧化氢酶，得到负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，即检测微单元；/n2)将所述负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球(检测微单元)固定在试纸上，得到尿酸检测试纸。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备尿酸检测试纸的方法，包括如下步骤：
1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载尿酸酶和过氧化氢酶，得到负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，即检测微单元；
2)将所述负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球(检测微单元)固定在试纸上，得到尿酸检测试纸。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)用水浸泡巯丙基琼脂糖球使其吸水膨胀，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与吸水膨胀后的巯丙基琼脂糖球反应，得到TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球；用TCEP或者DTT与尿酸酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液；用TCEP或者DTT与过氧化氢酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液；
(2)向TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液，反应，得到负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球，向得到的负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液，反应，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述巯丙基琼脂糖球为6B；尺寸范围为45-165微米，平均尺寸为90微米；
步骤(2)中，TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液中的尿酸酶、TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液中的过氧化氢酶的配比依次为：200μL：1-1000μg：1-1000μg；
尿酸酶的酶活为≥2units/mg；
过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述试纸...

【专利技术属性】
技术研发人员：马岚，薛超文，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44