本发明专利技术“一种木霉菌疏水蛋白Thfb6及其菌株、植物ISR激发子及激发方法”属于分子生物学领域。所述木霉菌疏水蛋白Thfb6的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。基于所述木霉菌疏水蛋白Thfb6，本发明专利技术还提供一种植物ISR激发子及其激发方法以及一种TMV抗性诱导剂及其诱导方法。本发明专利技术的木霉菌疏水蛋白Thfb6能够引起植物叶片发生活性氧爆发、诱导细胞胞外碱化、胼胝质和酚类物质积累等早期防御反应，提高叶片中PAL、POD、PPO等抗逆性酶活性提高，诱导病程相关蛋白基因PR‑1b、系统抗性标记基因NPR1以及防御反应关键酶基因PAL的表达，并诱导烟草提高对烟草花叶病的抗病性，同时还能诱导黄瓜对枯萎病抗性。
【技术实现步骤摘要】
一种木霉菌疏水蛋白Thfb6及其菌株、植物ISR激发子及激发方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种木霉菌疏水蛋白Thfb6及其菌株、植物ISR激发子及激发方法。
技术介绍
木霉菌(Trichodermaspp.)是广泛研究和应用的植物病害生防真菌，易于定植于植物根际并与植物建立有益的相互作用，诱导植物抗病性是木霉菌主要的防病机制之一。早在1997年，Bigirimana等首次证明了木霉可诱导植物抗病性，后来发现多种木霉菌能够诱导植物对病原物产生局部或系统抗性。其抗病性信号传递途径十分复杂，有多种信号途径参与，各途径中的信号调控因子交叉互作形成复杂的信号网络。能够诱导寄主防卫反应的生物来源和非生物来源的物质统称为激发子。第六次国际植物组织培养大会规定来自于植物的激发子称为内源激发子，来自于微生物的激发子的称为真激发子。研究发现，木霉菌能产生多种诱导植物产生诱导性系统抗病性(InducedSystemicResistance,ISR)的激发子(或诱导子)，不同激发子可激活植物不同的防御信号，是导致木霉菌诱导植物ISR反应的复杂信号网络的根本原因。木霉菌产生的蛋白类激发子已见报道的有十余种，分别为Cerato-platanins家族的Sm1和epl1、Swollenin、糖苷水解酶类Thph1和ThPG1、II型疏水蛋白等。疏水蛋白(hydrophobin)是真菌特有的小分子疏水性蛋白质，分子量约为8-30kDa，大部分疏水蛋白含有8个位置保守的半胱氨酸残基，两两配对形成4个二硫键。疏水蛋白表面活性很高，其最大的特性是具有双亲性，能够在气体-液体、气体-固体等两相界面自组装形成纳米级厚度的蛋白膜，微观呈现为密集、有序覆盖在表面的一端亲水另一端疏水的小棒状结构，帮助真菌形成气生菌丝和分生孢子，并利于孢子分化与扩散。疏水蛋白通常分为两类：I型和II型，分类依据为水缘性图谱(氨基酸疏水性-亲水性图谱)和组装成两性蛋白膜的溶解性。I型真菌疏水蛋白形成的两亲性蛋白膜高度难溶，100℃水浴仍难溶于2％SDS，仅溶解或解聚于蚁酸(formicacid)和三氟乙酸(TFA)等极少数有机溶剂中，代表性的I型疏水蛋白有裂褶菌中的SC3和SC4、双孢蘑菇(Agaricusbisporus)中的ABH1和粗糙脉胞菌(Neurosporacrassa)中的EAS等；II型疏水蛋白形成的两亲性蛋白膜则相反，可溶解或解聚于2％SDS或60％乙醇等多种有机溶剂中，在冷冻或高压下能解离成单体，如里氏木霉中的HFBI、HFBII和荷兰榆树病菌(Ophiostomaulmi)中的CU等。由于疏水蛋白独特的物理特性，已被针对性的开展应用领域的研究，如来自瑞氏木霉(T.reesei)的HFBⅠ、HFBⅡ被用于蛋白分离剂、乳化剂及包被材料等。近年来研究发现，疏水蛋白能作为激发子诱导植物ISR，如长枝木霉(T.longibrachiatum)HYTLO1能够激活百脉根ISR相关的防御反应，包括活性氧爆发、提高SOD、PPO、POD等抗逆性相关酶的活性、提高植物抗毒素以及病程相关蛋白表达等。棘孢木霉(T.asperellum)HBF2-6可诱导杨树JA和生长素信号途径相关基因高效表达。哈茨木霉hyd1能够诱导玉米的ISR，提高玉米对茎腐病及叶斑病的抗性。激发子引起植物的防御反应分为两个阶段。第一阶段发生在激发子作用于植物的几分钟内，包括活性氧(ROS)爆发、形成NO、离子流跨越细胞膜、胞外介质碱化等。第二个阶段发生在激发子与植物识别后的几小时到几天内，诱导植物产生多种防御信号，包括PR蛋白的表达、诱导次级代谢产物如胼胝质、酚类物质和木质素等积累、抗逆性相关酶基因的上调表达及酶活性提高，如苯丙氨酸解氨酶(Phenylalnineammonialyase，PAL)及PPO、SOD、POD等、(Blumwaldetal.,1998)。PR蛋白具有较高的稳定性可以在植物体内运输和积累，作用于特定的组织部位随着这些植物防御反应事件的发生，激发子最终激活植物的防御体系，产生系统抗性。有关木霉菌激发子诱导植物ISR的信号传递研究积累相对贫乏。因此本领域亟需开发更多的可诱导植物ISR的新的激发子和诱导剂。
技术实现思路
基于本领域上述迫切需求，本专利技术提供一种木霉菌疏水蛋白及其氨基酸序列以及该蛋白的应用。本专利技术的技术方案如下：一种木霉菌疏水蛋白Thfb6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1。所述的一种木霉菌疏水蛋白Thfb6的cDNA序列如SEQIDNO.2。所述的一种木霉菌疏水蛋白Thfb6为保藏号为CGMCCNo.19906的木霉菌Trichodermaharzianum菌株NM11分泌的疏水蛋白。一株哈茨木霉Trichodermaharzianum菌株NM11，其特征在于，其保藏号为CGMCCNo.19906。一种植物ISR激发子，其特征在于，包括，所述的一种木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的哈茨木霉Trichodermaharzianum菌株NM11分泌的木霉菌疏水蛋白Thfb6。所述的植物ISR激发子为异源表达的木霉菌疏水蛋白Thfb6；优选地，所述异源表达载体选自：原核表达载体、或，真核表达载体；所述原核表达载体选自pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-32a、pET-32b、pET-32c；所述真核表达载体选自：pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC；pPIC9；pHIL-S1；pPIC9K；优选地，所述植物ISR激发子为可表达木霉菌疏水蛋白Thfb6的转化体；优选地，所述转化体的宿主为大肠杆菌E.coli、毕赤酵母Pichiapastoris；更优选地，所述宿主为E.coliBL21DE3菌株、E.coliRosetta2DE3菌株、毕赤酵母KM71H菌株、GS115、X-33菌株；优选地，所述植物ISR激发子还包括缓冲液；所述缓冲液优选Tris-HCl缓冲液；优选地，所述植物ISR激发子为pH8.0、浓度为20umol/L的木霉菌疏水蛋白Thfb6的20mMTris-HCl溶液；更优选地，所述植物为烟草、黄瓜。除烟草、黄瓜外，本领域技术人员可基于本专利技术记载的内容将该蛋白应用于其它种属或类别的植物中用于激发植物ISR，并能获得与本专利技术类似的预期的ISR激发效果。一种植物ISR激发方法，其特征在于，采用所述的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的哈茨木霉Trichodermaharzianum菌株NM11分泌的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的植物ISR激发子处理植物；优选地，所述处理指，使所述的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的植物ISR激发子渗入植物体内；更优选地，所述渗入植物体内指通过注射进入植物叶片内，或，通过喷施在叶片表面渗入，所述植物为烟草、黄瓜。一种TMV抗性诱导剂，其特征在于，包括：所述的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种木霉菌疏水蛋白Thfb6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1。/n
【技术特征摘要】
1.一种木霉菌疏水蛋白Thfb6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1。
2.根据权利要求1所述的一种木霉菌疏水蛋白Thfb6，其特征在于，其cDNA序列如SEQIDNO.2。
3.根据权利要求1或2所述的一种木霉菌疏水蛋白Thfb6，其特征在于，为保藏号为CGMCCNo.19906的木霉菌Trichodermaharzianum菌株NM11分泌的疏水蛋白。
4.一株哈茨木霉Trichodermaharzianum菌株NM11，其特征在于，其保藏号为CGMCCNo.19906。
5.一种植物ISR激发子，其特征在于，包括，权利要求1-3任一所述的一种木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，权利要求4所述的哈茨木霉Trichodermaharzianum菌株NM11分泌的木霉菌疏水蛋白Thfb6。
6.根据权利要求5所述的植物ISR激发子，其特征在于，为异源表达的木霉菌疏水蛋白Thfb6；
优选地，所述异源表达载体选自：原核表达载体、或，真核表达载体；
所述原核表达载体选自pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-32a、pET-32b、pET-32c；
所述真核表达载体选自：pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC；pPIC9；pHIL-S1；pPIC9K；
优选地，所述植物ISR激发子为可表达木霉菌疏水蛋白Thfb6的转化体；
优选地，所述转化体的宿主为大肠杆菌E.coli、毕赤酵母Pichiapastoris；
更优选地，所述宿主为E.coliBL21DE3菌株、E.coliRosetta2DE3菌株、毕赤酵母KM71H菌株、GS115、X-33菌株；
优选地，所述植物ISR激发子还包括缓冲液；所述缓冲液优选Tris-HCl缓冲液；
【专利技术属性】
技术研发人员：李梅，蒋细良，黄佩，梅杰，田莹，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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