一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料制造技术

本发明专利技术公开一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，采用柱层析法将具有凝血活性的蛇毒凝血酶原激活物提取出来，通过改变层析条件和调节技术参数实现准确分离，并且可在常温下进行操作，对实验条件要求简单，容易放大生产，由于选择的层析柱可以反复使用，因此具有成本低、收率高和产品纯度高的优点，本发明专利技术的基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，能够最大限度的保持蛇毒凝血酶原激活物的活性和稳定性；安全无毒副作用，既能快速止血又能防止二次出血和感染，可以用于事故急救、手术止血和战时创伤止血时，尤其适用于动脉大出血，能够快速止血，并且不会产生二次创伤。

【技术实现步骤摘要】
一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料
本专利技术涉及止血材料
，具体说是一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料。
技术介绍
目前的止血材料有三类：第一类是通过材料的物理或化学作用，吸收伤口附近血液中的水分，使伤口处血液的凝血成分浓缩，聚集，从而加速凝血；或通过材料表面电荷与血细胞之间的静电作用，提高红细胞或血小板的粘附和聚集能力，增加血块粘性促进凝血，如沸石类，高岭土类，淀粉类，明胶类和海藻酸盐类等；第二类是利用材料对组织很强的粘着力直接封闭创面，从而实现止血。这类止血材料主要是人工合成高分子，比如：α-氰基丙烯酸酯类、PEG类等合成高分子，它们遇到血液后能迅速形成粘性很强的胶体，迅速封堵血管，从而止血；第三类是直接或间接提高具有止血活性的物质，止血材料通过表面有效化学或生物成分与血液成分进行反应，启动或提高内源性和外源性凝血途径，进而加速凝血。纤维蛋白胶、短肽类、凝血酶等类型的止血材料都是依靠快速启动血液的内源性止血系统来促进血液凝固，从而止血。沸石类止血时水合放热，对皮肤等软组织易造成损伤；高岭土类应用后不能完全从伤口处移除，可引起异物肉芽肿或脓肿形成；淀粉类对于难以控制的大出血，止血效果有限；明胶类需要机体的凝血因子参与才能止血，并且容易增加伤口感染，尤其是污染的伤口，并且黏附性差、易脱落，用于内脏止血需要丝线固定；壳聚糖类止血材料的止血机理是壳聚糖表面带正电荷，使得带负电的红细胞容易聚集在其表面，也可以激活血液中的补体系统，对血小板也有聚集作用，但是对于广泛的出血创面，壳聚糖的止血效果有限。第二类的止血材料可导致血管栓塞并且在降解过程中释放出氰和甲醛等有毒物质，可诱导注射部位周边产生炎症和组织坏死。氰基丙烯酸酯黏合剂对黏合组织的表面要求较高，在使用时必须保证干燥、洁净，不能有血液和消化液等存在。纤维蛋白胶已应用于临床肿瘤摘除后创面的广泛出血和肝、肾等实质脏器术中的出血等。但是，由于其具有黏合性和促凝作用，严禁应用于血管内以防止形成血栓阻塞血管。纤维蛋白胶的黏附力不好，易从伤口处脱落。目前常使用的纤维蛋白胶是由冻干粉和溶剂组成，使用时要先溶解，不适用突发情况，也不方便储存和运输，且纤维蛋白胶成本较高，种种原因限制了其使用。综上以上止血材料均存在一定的缺陷，首先对内脏大出血，尤其是动脉出血的直接止血作用有限，并没有有效的止血材料，因此，开发新的凝血酶原激活物，并将其应用到止血材料中达到有效止血，是目前亟待解决的。另外，蛇毒中含有多种促进血液凝固从而发挥止血作用的蛋白酶和活性多肽，比如目前临床上广泛使用的止血药立止血是从巴西洞蝮蛇的毒液中分离、提纯得到的高纯度蛇毒凝血毒素制剂，蛇毒中含有的凝血物质活性很高，但是目前的提纯方法对设备的要求高，提纯成本高，限制了新蛇毒凝血酶原激活物的开发，目前还没有蛇毒凝血酶原激活物被开发上市为止血试剂，因此，止血性能好，安全性好的蛇毒凝血酶原激活物类止血产品具有广阔的应用前景。综上，为了克服现有蛇毒止血物质和常用止血材料中存在的缺陷，如蛇毒止血物质制备流程复杂，制备成本高，止血材料对内脏大出血，尤其是动脉出血的直接止血作用有限。开发有效的蛇毒凝血酶原激活物并将其制备成止血时间短、止血性能好，尤其适合大动脉止血的材料具有重大的意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种蛇毒凝血酶原激活物，通过以下步骤制备得到：①将蛇毒冻干粉溶于0.05mol/L的PBS缓冲溶液中，过滤，所得滤液用凝胶柱分离纯化，填料为SephadexG-200，先用第一流动相洗脱5～8小时；再用第二流动相洗脱3～5小时；以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐得到浓缩液；蛇毒冻干粉和0.05mol/L的PBS缓冲溶液的质量比为1∶10～20；②将步骤①所得浓缩液进行凝胶柱层析，填料为DEAESepharoseFF，先用第一流动相洗脱5～8小时，再用第二流动相洗脱3～5小时，以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐、冻干得到蛇毒凝血酶原激活物；其中第一流动相为浓度0.05mol/L、pH6.0～7.0的PBS缓冲溶液，第一流动相中还包含质量浓度1～3％的硫酸铵；第二流动相为浓度0.20mol/L、pH6.0～7.0的PBS缓冲溶液，第二流动相中还包含质量浓度2～4％的硫酸铵；洗脱时的流速均为1～3ml/分钟。优选的，第一流动相中硫酸铵的质量浓度为2％；第二流动相中硫酸铵的质量浓度为3％。本专利技术还包括一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：蛇毒凝血酶原激活物0.01～0.5份，氧化石墨烯5～10份，聚乳酸80～100份，改性壳聚糖3～8份，氯化钙8～10份，纳米二氧化钛2～6份和聚乙烯吡咯烷酮1～5份；所述改性壳聚糖按照以下步骤制备得到：将二元羧酸加入到浓度为0.4～0.6mol/L氯化钠水溶液中，开启搅拌，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，在0～30℃下搅拌反应0.5～3小时，得到反应液；向所得反应液中加入壳聚糖的氯化钠水溶液中，在20～60℃下搅拌反应12～36小时，用分子量3500的透析袋透析，冷冻干燥，得到改性壳聚糖；二元羧酸、氯化钠水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖的氯化钠水溶液质量比为1～2∶50～100∶2～4∶2～4∶10～20；所述二元羧酸为丁二酸、戊二酸或己二酸；所述壳聚糖的氯化钠水溶液由1～2份壳聚糖分散在18～22份氯化钠水溶液中得到，其中氯化钠水溶液的摩尔浓度0.4～0.6mol/L。优选的，以重量份计，由以下组分组成：蛇毒凝血酶原激活物0.3～0.5份，氧化石墨烯5～8份，聚乳酸80～90份，改性壳聚糖4～6份，氯化钙8～9份，纳米二氧化钛3～5份和聚乙烯吡咯烷酮1～3份。优选的，聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮K30。优选的，二元羧酸为戊二酸。本专利技术还包括一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：(1)以重量份计，将80～100份聚乳酸加入到800～1000份有机溶剂中，加入氯化钙8～10份，纳米二氧化钛2～6份，改性壳聚糖3～8份，聚乙烯吡咯烷酮1～5份和氧化石墨烯4.5～9份，搅拌8～10小时，得到纺丝液，经静电纺丝成型，得到医用无纺布；其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比7～9∶1组成；(2)将蛇毒凝血酶原激活物0.01～0.5份和氧化石墨烯0.5～1份加入到20～40份水中，搅拌分散均匀得到混合液，将步骤(1)所得医用无纺布浸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛇毒凝血酶原激活物，其特征在于：通过以下步骤制备得到：/n①将蛇毒冻干粉溶于0.05mol/L的PBS缓冲溶液中，过滤，所得滤液用凝胶柱分离纯化，填料为Sephadex G-200，先用第一流动相洗脱5～8小时；再用第二流动相洗脱3～5小时；以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐得到浓缩液；/n蛇毒冻干粉和0.05mol/L的PBS缓冲溶液的质量比为1∶10～20；/n②将步骤①所得浓缩液进行凝胶柱层析，填料为DEAE Sepharose FF，先用第一流动相洗脱5～8小时，再用第二流动相洗脱3～5小时，以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐、冻干得到蛇毒凝血酶原激活物；/n其中第一流动相为浓度0.05mol/L、pH6.0～7.0的PBS缓冲溶液，第一流动相中还包含质量浓度1～3％的硫酸铵；/n第二流动相为浓度0.20mol/L、pH6.0～7.0的PBS缓冲溶液，第二流动相中还包含质量浓度2～4％的硫酸铵；/n洗脱时的流速均为1～3ml/分钟。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛇毒凝血酶原激活物，其特征在于：通过以下步骤制备得到：
①将蛇毒冻干粉溶于0.05mol/L的PBS缓冲溶液中，过滤，所得滤液用凝胶柱分离纯化，填料为SephadexG-200，先用第一流动相洗脱5～8小时；再用第二流动相洗脱3～5小时；以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐得到浓缩液；
蛇毒冻干粉和0.05mol/L的PBS缓冲溶液的质量比为1∶10～20；
②将步骤①所得浓缩液进行凝胶柱层析，填料为DEAESepharoseFF，先用第一流动相洗脱5～8小时，再用第二流动相洗脱3～5小时，以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐、冻干得到蛇毒凝血酶原激活物；
其中第一流动相为浓度0.05mol/L、pH6.0～7.0的PBS缓冲溶液，第一流动相中还包含质量浓度1～3％的硫酸铵；
第二流动相为浓度0.20mol/L、pH6.0～7.0的PBS缓冲溶液，第二流动相中还包含质量浓度2～4％的硫酸铵；
洗脱时的流速均为1～3ml/分钟。


2.根据权利要求1所述的一种蛇毒凝血酶原激活物，其特征在于：第一流动相中硫酸铵的质量浓度为2％；第二流动相中硫酸铵的质量浓度为3％。


3.一种基于权利要求1所述蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，其特征在于：以重量份计，由以下原料组成：蛇毒凝血酶原激活物0.01～0.5份，氧化石墨烯5～10份，聚乳酸80～100份，改性壳聚糖3～8份，氯化钙8～10份，纳米二氧化钛2～6份和聚乙烯吡咯烷酮1～5份；
所述改性壳聚糖按照以下步骤制备得到：
将二元羧酸加入到浓度为0.4～0.6mol/L氯化钠水溶液中，开启搅拌，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，在0～30℃下搅拌反应0.5～3小时，得到反应液；向所得反应液中加入壳聚糖的氯化钠水溶液中，在20～60℃下搅拌反应12～36小时，用分子量3500的透析袋透析，冷冻干燥，得到改性壳聚糖；
二元羧酸、氯化钠水溶液、1-乙基-(3-...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳梦，刘可春，王利振，段秀英，王荣春，张姗姗，张云，
申请(专利权)人：山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37