一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法技术

本发明专利技术提供了一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法。本发明专利技术首先以养殖鱼类匙吻鲟为对象，系统的研究并筛选到组分相对简单的冷冻保存液和简易的冷冻保存方法，且通过生殖细胞移植实验证明了复苏后制备得到性腺细胞的生殖干细胞特性，还将该方法应用到濒危鱼类中华鲟精巢冷冻保存。利用本发明专利技术提供的方法开展鲟鱼性腺组织超低温冷冻保存，复苏后制备性腺单细胞悬液，细胞活性可达90%以上，与新鲜性腺制备得到细胞的活性没有差异；进一步通过生殖细胞移植技术有效的评估了性腺细胞的生殖干细胞特性。本发明专利技术冷冻保存液组分简单、冻存方法操作便捷，为濒危鲟鱼种质资源长期保存和物种恢复提供了一条新的且有效的途径。

【技术实现步骤摘要】
一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法。
技术介绍
目前，全世界现存27个种，都被列入《国际濒危动植物贸易公约》附录I或II保护物种。它们的野生种群都处于不同程度的濒危状况，有的甚至已经灭绝。虽然多种鲟鱼的全人工繁殖已突破，但由于大多数鲟鱼具有个体大（体重可达几百公斤）、初次性成熟时间较长（需要十年以上）、且雌雄成熟不同的特点，导致在养殖和保种过程中需要投入大量的人力、物力和财力，造成养殖成本巨大且规模极有限。因此，有必要寻求新技术和方法，来加强鲟鱼种质资源的长期保存，以及后续物种恢复。鱼类卵子体积大、卵黄含量高和细胞膜通透性低导致鱼类卵子和胚胎的冷冻保存技术尚未突破。另一方面，鱼类精液冷冻保存技术已较成熟，且可通过雄核发育得到后代，但雄核发育的成功率和后代个体成活率都非常低，而且只具有单亲的遗传信息。目前相对有效的鱼类种质资源保存方法是活体养殖。但是，活体养殖的方法也具有很大风险，如养鱼设施故障、疾病爆发、遗传多样性和对自然环境的适应性降低。因此，建立携带双亲遗传物质的性腺组织冷冻保存技术，再结合生殖细胞移植技术，可以实现种质资源的长期保存以及后续物种恢复。鲟鱼中，目前仅见达氏鲟精巢细胞冷冻保存液及精巢细胞冷冻保存方法的研究。该研究以冻存细胞为载体，未涉及对性腺组织的研究；且其冷冻保存液组分和冷冻程序较复杂；其中最重要的关键点：“复苏后的精巢细胞是否具有生殖干细特性”也是未知。
技术实现思路
r>本专利技术提供了一种组分较为简单的鲟鱼性腺组织的冷冻保存液，利用该保存液，能实现鲟鱼性腺组织的长期保存，复苏制备的细胞具备生殖干细胞特性，从而达到种质资源的长期保存。本专利技术的另一个目的在于建立一种相对简单、易操作的冷冻保存及复苏方法，可应用到养殖试验基地。为了达到上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液，所述冷冻保存液包括：L-15培养基、1.0mol/L～1.6mol/L二甲亚砜、0.1mol/L～0.3mol/L海藻糖和体积分数为5%～15%的胎牛血清，所述浓度均为在L-15培养基中的浓度，胎牛血清体积分数为在L-15培养基中的体积分数。进一步的，所述冷冻保存液包括：L-15培养基、1.3mol/L二甲亚砜、0.1mol/L海藻糖和体积分数为10%的胎牛血清。本专利技术还提提供了采用所述冷冻保存液的冷冻保存及复苏的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：（1）解剖取出鲟鱼性腺组织，用预冷的PBS清洗血块；（2）称取性腺组织的重量，然后将性腺组织剪碎，用L-15培养基清洗，离心，弃上清液，将性腺组织置于冰上备用；（3）向性腺组织中加入冷冻保存液，混匀，装于冻存管中，进行冷冻处理，然后保存在液氮中；（4）复苏：将冻存管从液氮中取出解冻，将性腺组织转移至离心管中，用L-15培养基清洗；（5）将复苏后的性腺组织用消化液进行消化，停止消化后进行过滤，离心弃上清；然后再加入L-15培养基，使细胞终浓度为精巢细胞数目为5×106~9×106个细胞，卵巢细胞数目为2×107~4×107个细胞，离心，弃上清，加入染色剂染色；加入L-15培养基阻止反应，离心后弃上清，加入L-15培养基重新悬浮细胞，加入FBS和DNaseI，置于冰上备用。进一步的，所述鲟鱼为中华鲟或匙吻鲟。进一步的，所述步骤（3）中性腺组织与冷冻保存液的比例为1:10～20，性腺组织的单位g，冷冻保存液的单位为ml。进一步的，所述步骤（3）中冷冻处理的方法为：先将冻存管和程序降温盒置于冰上1h~2h，然后把冻存管转移到程序降温盒−80℃~−90℃保存1.5h～2h。进一步的，所述步骤（4）中解冻温度为23℃～25℃，解冻时间为1min～2min。进一步的，所述步骤（5）中所述消化液为2mg/mlCollagenaseH、500U/mlDispaseⅡ、5%FBS和0.05%DNaseI溶于L-15培养基制得。进一步的，所述步骤（5）中性腺组织消化的时间分别为：精巢消化4h~5h，卵巢消化3h~4h。进一步的，所述步骤（5）中停止消化的方法为加入体积分数10%胎牛血清停止消化。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：本专利技术提供的一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法，不仅配方组分简单、程序操作便捷，而且能长期有效的保存鲟鱼性腺组织，复苏后制备的性腺细胞具备很高的活性，且具有生殖干细胞特性，为濒危鲟鱼种质资源的长期保存及后续物种恢复提供了一条有效的途径。本专利技术首先以养殖鱼类匙吻鲟为对象，系统的研究并筛选到组分相对简单的冷冻保存液和简易的冷冻保存方法，且通过生殖细胞移植实验证明了复苏后制备得到性腺细胞的生殖干细胞特性。还将该方法应用到濒危鱼类中华鲟精巢冷冻保存，取得了非常好的效果。因此，本专利技术提供了一种有效的鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存方法，为濒危鲟鱼种质资源长期保存和物种恢复提供了一条新的且有效的途径。附图说明图1为匙吻鲟精巢和卵巢经不同渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性，其中，A和B为匙吻鲟精巢经不同渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性；C和D为为匙吻鲟卵巢经不同渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性。图2为匙吻鲟精巢和卵巢经不同非渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性，其中，A和B为匙吻鲟精巢经不同非渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性；C和D为匙吻鲟卵巢经不同非渗透性冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性。图3为匙吻鲟精巢和卵巢经不同冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性，其中，A和B为匙吻鲟精巢经不同冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性；C和D为匙吻鲟卵巢经不同冷冻保护剂冻存复苏后制备得到细胞的数目和活性。图4为移植后第60天供体匙吻鲟生殖细胞嵌合到受体达氏鲟幼鱼性腺，其中，A和B分别为供体匙吻鲟精原细胞嵌入受体性腺在荧光和白光下的视野；C和D分别为供体匙吻鲟卵原细胞嵌入受体性腺在荧光和白光下的视野；E和F分别为未移植达氏鲟幼鱼性腺在荧光和白光下的视野。图5为移植后第60天供体中华鲟精原细胞嵌合到受体达氏鲟幼鱼性腺，其中，A和B分别为供体中华鲟精原细胞嵌入受体性腺在荧光和白光下的视野；C和D分别为未移植达氏鲟幼鱼性腺在荧光和白光下的视野。具体实施方式：以下实施例旨在进一步说明本专利技术的内容，而不是限制本专利技术的保护范围。本专利技术提供了一种鲟鱼性腺组织冷冻保存及复苏的方法，所述方法包括以下步骤：（1）解剖取出鲟鱼性腺组织，用预冷的PBS清洗血块；（2）称取性腺组织的重量，将性腺组织剪碎，用L-15培养基清洗，离心，弃上清液，将性腺组织置于冰上备用；（3）将性腺组织中加入冷冻保存液，混匀，装于冻存管中，先将冻存管置本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液，其特征在于：所述冷冻保存液包括：L-15培养基、1.0 mol/L～1.6mol/L 二甲亚砜、0.1mol/L～0.3mol/L海藻糖和体积分数为5%～15%的胎牛血清。/n

【技术特征摘要】
1.一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液，其特征在于：所述冷冻保存液包括：L-15培养基、1.0mol/L～1.6mol/L二甲亚砜、0.1mol/L～0.3mol/L海藻糖和体积分数为5%～15%的胎牛血清。


2.根据权利要求1所述的冷冻保存液，其特征在于：所述冷冻保存液包括：L-15培养基、1.3mol/L二甲亚砜、0.1mol/L海藻糖和体积分数为10%的胎牛血清。


3.采用权利要求1所述冷冻保存液的冷冻保存及复苏的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）解剖取出鲟鱼性腺组织，用预冷的PBS清洗血块；
（2）称取性腺组织的重量，然后将性腺组织剪碎，用L-15培养基清洗，离心，弃上清液，将性腺组织置于冰上备用；
（3）向性腺组织中加入冷冻保存液，混匀，装于冻存管中，进行冷冻处理，然后保存在液氮中；
（4）复苏：将冻存管从液氮中取出解冻，将性腺组织转移至离心管中，用L-15培养基清洗；
（5）将复苏后的性腺组织用消化液进行消化，停止消化后进行过滤，离心弃上清；然后再加入L-15培养基，使精巢细胞终浓度为5×106~9×106个细胞，使卵巢细胞终浓度为2×107~4×107个细胞；离心，弃上清，加入染色剂染色，加入L-15培养基阻止反应；离心后弃上清，加入L-15培养基重新悬浮细胞，加入FBS和DNaseI...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶欢，李创举，危起伟，周从利，岳华梅，阮瑞，杜浩，武梦斌，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42