一种评估猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群调节能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种评估猴头菇β‑葡聚糖对肠道菌群调节能力的方法，其特征在于，准备猴头菇β‑葡聚糖、粪便供试液；猴头菇β‑葡聚糖体外粪便发酵：将粪便悬浊液接种于猴头菇β‑葡聚糖中，37℃厌氧发酵，对肠道微生物进行体外培养；检测发酵液中肠道微生物对猴头菇β‑葡聚糖的代谢产物的响应值；然后进行高通量测序。本发明专利技术通过猴头菇β‑葡聚糖粪便菌群体外发酵过程中短链脂肪酸的产量变化，以及通过高通量测序检测粪便菌群体外发酵中微生物种属的变化，提供了与猴头菇β‑葡聚糖利用能力显著相关的4种肠道微生物菌属，通过菌属的变化以此判断猴头菇β‑葡聚糖对健康的影响。

【技术实现步骤摘要】
一种评估猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群调节能力的方法
本专利技术涉及一种猴头菇β-葡聚糖在调节动物肠道菌群中的用途，具体涉及一种利用肠道菌群体外粪便发酵和微生物测序结果评估猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群调节能力的方法。
技术介绍
猴头菇(Hericiumerinaceus)又名猴头菌、刺猬菌等，是一种珍贵的药食两用菌，包含多种维生素及9种人体必需的氨基酸；猴头菇还具有多种生物活性物质，如多糖、寡糖、氨基酸、甾醇类、萜类和酚类等；同时猴头菇还具有很高的保健价值，具有抗氧化、提高免疫力、抗衰老等多种生物学功能。猴头菇β-葡聚糖(HEBG)是猴头菇多糖中重要组成成分，具有降血糖、抗氧化、加速伤口愈合等多种功效。近年来猴头菇β-葡聚糖因其所具有的多种生物活性而备受关注，目前市场上也出现了以猴头菇多糖为主要功效成分的功能性食品。短链脂肪酸(shortchainfattyacids,SCFA)，是人体结肠细菌发酵的主要产物。主要包括乙酸、丙酸和丁酸。短链脂肪酸主要来自大肠内碳水化合物发酵和蛋白质降解，肠道菌群通过产生短链脂肪酸，对人体多个器官和代谢产生较大的影响，从而影响身体健康。研究认为，猴头菇β-葡聚糖在人体的消化吸收过程中，可被肠道中的微生物利用，产生短链脂肪酸，因此，猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群的调节能力决定了猴头菇β-葡聚糖对个体健康的影响。同时，随着肠道菌群的测序技术的发展和普及，根据肠道菌群测序结果能更直接的判断猴头菇β-葡聚糖对健康的影响。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：如何评估猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群调节能力。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种评估猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群调节能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)：准备猴头菇β-葡聚糖；步骤2)：准备粪便供试液：将粪便加入到PBS溶液中，蜗旋混匀，然后过滤，去除大颗粒，获得粪便悬浊液；步骤3)：猴头菇β-葡聚糖体外粪便发酵：将粪便悬浊液接种于猴头菇β-葡聚糖制成的发酵培养基中，37℃厌氧发酵，对肠道微生物进行体外培养；步骤4)：发酵液中肠道微生物对猴头菇β-葡聚糖的代谢产物的响应值的检测：采用气相色谱法检测肠道微生物的代谢产物的含量；步骤5)：高通量测序：取待测粪便各，将猴头菇β-葡聚糖以及低聚果糖分别接种于步骤3)所得的发酵培养基中进行体外粪便发酵后，提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板选择16SrDNA的V3-V4区域进行扩增测序，进行高通量测序。优选地，所述步骤1)中猴头菇β-葡聚糖的制备方法为：采用水提醇沉的方法，先将猴头菇粉与水按照重量比混合，加热蒸煮后浓缩，高速离心得到沉淀，用蒸馏水溶解该沉淀物，并透析2～3天，透析液冷冻干燥后即得猴头菇β-葡聚糖。优选地，所述步骤2)中的粪便为人类粪便，其样品提供者在采样前2个月内未服用过抗生素或益生元。优选地，所述步骤2)中PBS溶液使用前经灭菌、厌氧处理；所述PBS溶液的pH值为7.0，浓度为0.1M；所得粪便悬浊液的浓度为0.1g/mL。优选地，所述步骤2)中过滤所采用的滤网规格为800目。优选地，所述步骤3)中发酵培养基为含4g/L猴头菇β-葡聚糖的基础培养基，其包括：蛋白胨5g/L，酵母提取物2.5g/L，NaCl2g/L，CaCl20.1g/L，K2HPO40.25g/L，MgSO40.1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.8g/L，血红素0.05g/L，刃天青0.1mg/L、生物素10μg/L、吐温-802.0mL/L，溶剂为去离子水，pH值自然。优选地，所述步骤4)中猴头菇β-葡聚糖的代谢产物为短链脂肪酸。更优选地，所述猴头菇β-葡聚糖的代谢产物为乙酸、丙酸和丁酸中的至少一种。优选地，所述步骤4)中的气相色谱法以巴豆酸偏磷酸溶液为内标与酸化剂。更优选地，所述巴豆酸偏磷酸溶液的浓度为75mM。优选地，所述步骤5)中的发酵时间为24h。猴头菇β-葡聚糖是猴头菇多糖中的重要组成成分，具有多种功效，其可被肠道中的微生物利用，进而影响机体的健康。猴头菇β-葡聚糖能显著提高肠道菌群产生短链脂肪酸的含量，进而发挥增强免疫力、减肥、降血糖、降血压、降血脂、抗肿瘤等功效。本专利技术通过猴头菇β-葡聚糖粪便菌群体外发酵过程中短链脂肪酸的产量变化，以及通过高通量测序检测粪便菌群体外发酵中微生物种属的变化，提供了与猴头菇β-葡聚糖利用能力显著相关的4种肠道微生物菌属，通过菌属的变化以此判断猴头菇β-葡聚糖对健康的影响。附图说明图1-4为第一个志愿者对应的猴头菇β-葡聚糖粪便菌群体外发酵过程中短链脂肪酸变化趋势图；图5-8为第二个志愿者对应的猴头菇β-葡聚糖粪便菌群体外发酵过程中短链脂肪酸变化趋势图；图9-12为第三个志愿者对应的猴头菇β-葡聚糖粪便菌群体外发酵过程中短链脂肪酸变化趋势图；图13-15为猴头菇β-葡聚糖粪便菌群体外发酵24h后短链脂肪酸的比例；图16为肠道菌群在门水平上的相对丰度；图17为厚壁菌门与拟杆菌门的比值；图18为肠道菌群在属水平上的相对丰度。具体实施方式为使本专利技术更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。实施例一种评估猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群调节能力的方法：步骤一：猴头菇β-葡聚糖的制备按以下步骤对猴头菇子实体进行提取，具体的步骤为：采用水提醇沉的方法，将猴头菇粉与水按照重量比1:25混合，加热蒸煮2h，提取液按浓缩比1:4浓缩，以10000r/min速度离心20分钟，离心后取上清液至6℃冰箱18h，10000r/min高速离心得到沉淀，沉淀用质量浓度为30％乙醇醇洗，蒸馏水溶解，采用3500Da的透析袋，透析3天，再将透析液进行冷冻干燥后即获得猴头菇β-葡聚糖。步骤二：取粪便人体粪便样品由三位志愿者提供，志愿者要求身体健康，采样前2个月内没有服用过抗生素、益生元等。以15mL离心管称取0.8g粪便，加入8mL经过灭菌，厌氧处理的pH7.0、0.1MPBS，旋蜗混匀，以800目滤网过滤，去除大颗粒，获得0.1g/mL的粪便悬浊液。步骤三：猴头菇β-葡聚糖体外粪便发酵所述方法为：将三位正常个体粪便悬浊液分别接种于发酵培养基中进行37℃厌氧发酵培养，所述发酵培养基为碳水化合物的基础培养基，所述碳水化合物为猴头菇β-葡聚糖(所述发酵培养基为含4g/L猴头菇β-葡聚糖的基础培养基，其包括：蛋白胨5g/L，酵母提取物2.5g/L，NaCl2g/L，CaCl20.1g/L，K2HPO40.25g/L，MgSO40.1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.8g/L，血红素0.05g/L，刃天青0.1mg/L、生物素10μg/L、吐温-802.0mL/L，溶剂为去离子水，pH值自然)，通过肠道微生物的体外培养，检测发酵液中肠道微生物对猴头菇β-葡聚糖的一系列的代谢产物的响应值，包括乙酸、丙酸、丁酸等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种评估猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群调节能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1)：准备猴头菇β-葡聚糖；/n步骤2)：准备粪便供试液：将粪便加入到PBS溶液中，蜗旋混匀，然后过滤，去除大颗粒，获得粪便悬浊液；/n步骤3)：猴头菇β-葡聚糖体外粪便发酵：将粪便悬浊液接种于猴头菇β-葡聚糖制成的发酵培养基中，37℃厌氧发酵，对肠道微生物进行体外培养；/n步骤4)：发酵液中肠道微生物对猴头菇β-葡聚糖的代谢产物的响应值的检测：采用气相色谱法检测肠道微生物的代谢产物的含量；/n步骤5)：高通量测序：取待测粪便各，将猴头菇β-葡聚糖以及低聚果糖分别接种于步骤3)所得的发酵培养基中进行体外粪便发酵后，提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板选择16SrDNA的V3-V4区域进行扩增测序，进行高通量测序。/n

【技术特征摘要】
1.一种评估猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群调节能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：准备猴头菇β-葡聚糖；
步骤2)：准备粪便供试液：将粪便加入到PBS溶液中，蜗旋混匀，然后过滤，去除大颗粒，获得粪便悬浊液；
步骤3)：猴头菇β-葡聚糖体外粪便发酵：将粪便悬浊液接种于猴头菇β-葡聚糖制成的发酵培养基中，37℃厌氧发酵，对肠道微生物进行体外培养；
步骤4)：发酵液中肠道微生物对猴头菇β-葡聚糖的代谢产物的响应值的检测：采用气相色谱法检测肠道微生物的代谢产物的含量；
步骤5)：高通量测序：取待测粪便各，将猴头菇β-葡聚糖以及低聚果糖分别接种于步骤3)所得的发酵培养基中进行体外粪便发酵后，提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板选择16SrDNA的V3-V4区域进行扩增测序，进行高通量测序。


2.如权利要求1所述的评估猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群调节能力的方法，其特征在于，所述步骤1)中猴头菇β-葡聚糖的制备方法为：采用水提醇沉的方法，先将猴头菇粉与水按照重量比混合，加热蒸煮后浓缩，高速离心得到沉淀，用蒸馏水溶解该沉淀物，并透析2～3天，透析液冷冻干燥后即得猴头菇β-葡聚糖。


3.如权利要求1所述的评估猴头菇β-葡聚糖对肠道菌群调节能力的方法，其特征在于，所述步骤2)中的粪便为人类粪便，其样品提供者在采样前2个月内未服用过抗生素或益生元；所述PBS溶液使用前经灭菌、厌氧处理；所述PBS溶液的pH值为7.0，浓度为0.1M；所得粪便悬浊液的浓度为0.1g/mL。

【专利技术属性】
技术研发人员：冯涛，李文远，庄海宁，姚凌云，宋诗清，孙敏，王化田，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：上海;31