发根农杆菌介导的植物转化系统及其方法技术方案

本申请涉及植物组织培养和转化领域，特别地涉及发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的植物(尤其是向日葵)转化技术。本申请建立了由发根农杆菌介导的向日葵转化，并获得复合植物的技术体系。

【技术实现步骤摘要】
发根农杆菌介导的植物转化系统及其方法
本专利技术涉及生物
，特别地涉及植物转化
，更特别地涉及双子叶植物的转基因技术。本专利技术建立了发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)介导的向日葵及其他双子叶植物的转化系统。
技术介绍
发根农杆菌(一种格兰氏阴性细菌)能致使植物在受伤部位产生不定发状根。由发根农杆菌介导的植物转化获得的发根，在没有任何植物体外生长调节素的作用下，能快速地派生出大量的侧根[1]。同时，发根农杆菌能将含有外源基因的T-DNA由Ri质粒整合到植物基因组中，或者在共转化时，双元载体的T-DNA区域也可以整合到植物基因组中[2][3]。发根农杆菌介导的转化方法具有快速简单的优点，为基因功能研究和根生物生理研究提供了一个有力的工具[4]。具体的，发根的应用有以下几个方面。发根转化尤其适合应用于涉及到根系生物学的基因功能研究，如那些在共生和致病相互作用、营养吸收和激素转运中起作用的基因[5]。在大豆上，K599能有效地诱导多个品种子叶上的毛状根，其离体培养的毛状根可用于大豆胞囊线虫的繁殖，为大豆胞囊线虫的功能研究提供了一种简便有效的工具[6]。发根的大量培养对于高价值的次生代谢产物的积累是一个独特的方法。而且，发根也通常应用于次生代谢物代谢途径的研究。除此之外，发根也可应用于植物生物强化、重金属生物积累、植物生长修复以及人工种子等领域[7][8]。复合植物是通过发根农杆菌介导的植物转化获得的一种植物形式。它包含了两部分：地上部分，非转基因的野生型的幼芽、茎和叶片等；地下部分，转基因的发根。这种植物形式的最大优势是，转基因发根与非转基因的茎和叶片部分的组合形成完整植株，大大延长了发根的存活期，拓展了发根的应用[1]。复合植物的应用一般包括以下几个方面：首先，复合植物的应用包括了所有发根的应用领域；其次，复合植物可用于与根茎互作相关的植物修复、植物营养和发育的研究；还可应用于基于植物的疫苗开发、感应作用和功能基因组学等方面的研究。在我们的研究中，我们将复合植物体系应用于寄生植物向日葵列当(OrobanchecumanaWallr.)对于寄主植物侵染萌发寄生瘤的病理研究。植物发根农杆菌转化系统在植物转化领域的研究与应用由来已久，尤其是在双子叶植物的研究中很普遍。可是，发根农杆菌介导的向日葵转化却不多见。迄今为止，我们仅检索到一篇关于向日葵发根转化的报道，Yakupova等人利用发根农杆菌菌株a4和15834对向日葵子叶进行转化，获得了独立的发根[9]。该文章报道的体系的不足之处在于，该体系获得的发根是独立的，并不是复合植株，而且操作繁琐，转化周期长。为解决以上技术问题，本专利技术提供了一种实验操作简单、转化周期短、无基因型依赖的发根农杆菌介导的植物转化系统，其中转化产物是复合植物，其生理特性优于独立的转基因发根。进一步地，相对于现有植物转化体系，本专利技术的优势包括：1.根癌农杆菌介导的植物转化和基因枪转化是现阶段向日葵转化领域中应用的最主要的方法[10]。这两种转化方法都有明显的局限性，包括：长周期的转化和组织培养过程，劳动量大，消耗资源多，而且具有很明显的基因限制性，很难实现高通量的生产，限制了基因功能研究的拓展。而发根农杆菌介导的向日葵转化方法具有操作简单、周期短、通量大的明显优势[11]。2.一般的发根农杆菌介导的植物转化获得转化体都是独立的发根。而本专利技术获得的转化体是复合植株，转基因发根离开培养基环境后存活时间从不长于一周可延长至三周以上。而且，复合植物的离体培养不需要培养基，减少了时间和资源的成本投入，这样大大拓展了发根的科学研究和生产前景。3.传统的获得复合植物的方法通常采用萌发了近一周的植物，在其茎上进行农杆菌注射，等转基因发根萌发到一定长度后，再去除自然根。该方法对于植物培养条件要求繁琐，全程需要特殊的高湿度密闭培养箱[11]。相对于现有的发根农杆菌介导的植物转化方法，本专利技术的优势体现在转化流程、植物培养条件上得以大大简化。这是因为，本专利技术的转化外植体选择的是下胚轴连接着子叶的种子部分，其关键在于包含了顶端生长点的子叶节部分。这样的外植体保证了在经过农杆菌转化后，转化产物是完整的复合植物，包含了地下部分和地上部分，即转基因的发根和非转基因的茎和叶。这是直接的获得复合植物的方法，提高了转化效率。4.本专利技术不仅适用于向日葵多个品种的转化，而且已成功地在多个大豆品种上实现转化，并获得了复合植物。
技术实现思路
总体而言，本专利技术涉及一种发根农杆菌介导的植物遗传转化方法，其包括以下步骤：1)种子消毒与萌发选择饱满的植物种子用于进行消毒；将消毒后的种子播种于含有培养基的培养皿中，并置于适宜于种子萌发的环境中萌发培养；2)外植体分离选取萌发好的种子，切除接近根一端的一段下胚轴，剩下的种子部分作为外植体用于侵染；3)侵染与共培养将外植体浸入农杆菌悬浮液中浸染，然后将外植体转移到培养皿中进行共培养；4)筛选培养与根诱导培养共培养完后，将外植体转移到筛选培养基上培养，并诱导生根，直到获得复合植物。在一个进一步的实施方案中，所述消毒通过下述方式来进行：用75％的酒精进行表面消毒，然后用次氯酸钠溶液浸泡15分钟，最后用超纯水润洗多次。在一个进一步的实施方案中，所述适宜于种子萌发的环境为处于室温且光照/黑暗替换周期为16/8小时的环境。在一个进一步的实施方案中，所述共培养进行2到5天，在培养皿中铺有滤纸，且滤纸上含有液体共培养基。在一个进一步的实施方案中，在共培养时，将滤纸平铺于培养皿中，加入液体培养基，然后将外植体置于滤纸上。在一个进一步的实施方案中，所述外植体来自于萌发1至7天的种子，优选地萌发3至7天的种子。在一个进一步的实施方案中，用于外植体分离的种子不带种皮或者带有部分种皮。在一个进一步的实施方案中，所述外植体分离通过下述方式来进行：选取萌发好的种子，在接近生长点的子叶节部分，切除下胚轴，并在切口处制造伤口，而剩下的种子部分作为外植体用于侵染。在一个进一步的实施方案中，所述外植体分离通过下述方式来进行：选取萌发好的种子，在接近生长点的子叶节部分，切除下胚轴，并在切口处制造伤口，同时去掉部分子叶，而剩下的种子部分作为外植体用于侵染。在一个进一步的实施方案中，在筛选培养阶段，所使用的筛选剂为草铵膦，并且其浓度范围为4-8mg/L，优选4mg/L。在一个进一步的实施方案中，在筛选培养阶段，在筛选培养一周以后，降低或去除筛选剂，从而短期内增殖发根。在一个进一步的实施方案中，在将外植体浸入农杆菌悬浮液中浸染时，通过离心或震荡来加强基因转化进细胞中。在一个进一步的实施方案中，所述离心采用600-1000rpm的转速。在一个进一步的实施方案中，通过所述方法所获得的转化产物为复合植物，其不仅包括发根，而且还包括完整的地上部分。在一个进一步的实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发根农杆菌介导的植物遗传转化方法，其包括以下步骤：/n1)种子消毒与萌发/n选择饱满的植物种子用于进行消毒；/n将消毒后的种子播种于含有培养基的培养皿中，并置于适宜于种子萌发的环境中萌发培养；/n2)外植体分离/n选取萌发好的种子，切除接近根一端的一段下胚轴，剩下的种子部分作为外植体用于侵染；/n3)侵染与共培养/n将外植体浸入农杆菌悬浮液中浸染，然后将外植体转移到培养皿中进行共培养；/n4)筛选培养与根诱导培养/n共培养完后，将外植体转移到筛选培养基上培养，并诱导生根，直到获得复合植物。/n

【技术特征摘要】
1.一种发根农杆菌介导的植物遗传转化方法，其包括以下步骤：
1)种子消毒与萌发
选择饱满的植物种子用于进行消毒；
将消毒后的种子播种于含有培养基的培养皿中，并置于适宜于种子萌发的环境中萌发培养；
2)外植体分离
选取萌发好的种子，切除接近根一端的一段下胚轴，剩下的种子部分作为外植体用于侵染；
3)侵染与共培养
将外植体浸入农杆菌悬浮液中浸染，然后将外植体转移到培养皿中进行共培养；
4)筛选培养与根诱导培养
共培养完后，将外植体转移到筛选培养基上培养，并诱导生根，直到获得复合植物。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述消毒通过下述方式来进行：用75％的酒精进行表面消毒，然后用次氯酸钠溶液浸泡15分钟，最后用超纯水润洗多次。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述适宜于种子萌发的环境为处于室温且光照/黑暗替换周期为16/8小时的环境。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述共培养进行2到5天，在培养皿中铺有滤纸，且滤纸上含有液体共培养基。


5.根据权利要求1所述的方法，其中在共培养时，将滤纸平铺于培养皿中，加入液体培养基，然后将外植体置于滤纸上。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述外植体来自于萌发1至7天的种子，优选地萌发3至7天的种子。


7.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：文琴，于鲲，刘清利，许建平，
申请(专利权)人：先正达生物科技中国有限公司，先正达农作物保护股份公司，
类型：发明
国别省市：北京;11