一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及应用。所述方法为利用序列特异核酸酶基因组编辑技术对作物Wx基因的起始密码子上游部分进行位点特异性突变，创建作物Wx基因表达水平改变的突变系。利用本发明专利技术方法不同程度地降低了水稻突变系胚乳的OsWx基因表达量，快速有效地获得了胚乳直链淀粉含量适度下降、胚乳胶稠度适度增加的蒸煮和食味特性更好的新品系。利用该方法获得不同直链淀粉含量和胶稠度的作物突变系，大大丰富了作物的种质资源，快速培育优质新品种；因此，该方法在调控作物种子直链淀粉含量和/或胶稠度、以及培育优质水稻品系或品种中具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及应用
本专利技术属于植物生物
更具体地，涉及一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及应用。
技术介绍
作物如水稻、小麦和玉米等种子的胚乳主要成分为淀粉，是人类和动物摄取碳水化合物食物的主要来源；胚乳淀粉主要是由直链淀粉和支链淀粉构成，两者的比例变化会影响淀粉制品的硬度、粘度、糊化温度和胶稠度等理化性质，直链淀粉含量越高，则直链淀粉越硬、粘度越小、胶稠度越低，从而影响淀粉制品的食用口感和食品加工特性。另一方面，工业用途的淀粉也需要直链淀粉含量高的淀粉。因此，开发不同直链淀粉含量的淀粉制品能够满足不同人群的消费要求和食品工业的需求。不同作物胚乳的直链淀粉是由高度保守的直系同源基因-Waxy基因(简称Wx，也称为蜡质基因)控制，它编码一种功能保守的植物淀粉合成的关键酶-颗粒结合淀粉合成酶(Granule-BoundStarchSynthaseI，GBSSI)，Wx基因的不同等位变异会导致胚乳的直链淀粉含量和胶稠度的变化。在水稻(OryzasativaL.)中，不同亚种类型(籼稻和粳稻)和不同品种的稻米(胚乳)的直链淀粉含量有明显差异；其中，典型的籼稻品种(O.sativaL.sspindica)的直链淀粉含量在25％左右，米饭较硬；粳稻品种(O.sativaL.sspjaponica)和部分导入粳稻血缘的籼稻的直链淀粉含量在15％～18％左右，米饭软硬适中，符合大部分人的食味喜好；少量原产于云南的软米品种的直链淀粉含量在10％～11％左右，米饭偏软。糯稻品种(籼糯和粳糯)的直链淀粉含量在2％左右，米饭黏软，是粽子、糕点等的用料。以上水稻胚乳直链淀粉含量的差异主要是由于位于第6染色体的OsWaxy基因(简称OsWx，基因号：Os06g0133000)的不同变异型控制，典型籼稻的为OsWxa型，在进化上属于强功能的原始型；粳稻的为功能弱化的变异型OsWxb型；软米稻的为功能更弱化的变异型OsWxmp型；糯稻的为功能完全丧失的oswx突变型；即OsWx功能越强，水稻种子胚乳中的直链淀粉含量越高。由于直链淀粉含量高的水稻品种的口感较差，为了培育直链淀粉含量适中、食用口感较好的优质籼稻品种，现有传统的育种方法为：利用作物种质资源中存在的自然突变产生的Wx等位基因进行杂交和回交选育新品种；例如，采用杂交和回交的方法把粳稻的OsWxb等位基因转移到籼稻背景品种中替换原有的OsWxa。但是，该方法存在以下局限性：(1)可利用的Wx等位基因种类少，如在水稻中，主要为籼型OsWxa(直链淀粉含量约25％)，粳型OsWxb(直链淀粉含量约15％～18％)和糯型oswx(直链淀粉含量约2％)；(2)需要多代回交，育种时间长。近年来，序列特异性核酸酶基因组编辑技术，如TALENs技术、CRISPR/Cas(包括多种Cas酶如Cas9、Cas12a等)技术已经发展成熟，并在各种生物中成功应用。现有技术中，Ma等通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术，对粳稻品种台中65的OsWx基因的编码区进行编辑，产生移码突变敲除了此基因的功能，获得了直链淀粉为2％左右的糯稻新材料(ArobustCRISPR/Cas9systemforconvenient,high-efficiencymultiplexgenomeeditinginmonocotanddicotplants.MolecularPlant8:1274-1284,2015)。范美英等通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对水稻品种秀水134的OsWx基因的编码区进行编辑，产生移码突变敲除了此基因的功能，得到了直链淀粉降低到1.6％～2.1％左右的糯稻新材料(利用CRISPR/Cas9技术创制糯稻新材料，2019)。申请号为201911186091.1的现有专利公开了一种通过基因编辑降低水稻直链淀粉含量的方法及其专用sgRNA，在OsWx基因的第7外显子区域设计sgRNA靶点序列，产生移码突变敲除了该基因功能，获得了直链淀粉含量降低到2％左右的糯稻新种质。但是，以上现有技术均为编辑OsWx基因的编码区产生移码等突变类型，即只是简单地敲除OsWx基因的功能，产生该基因功能失活的突变体，得到直链淀粉含量很低(2％左右)的糯稻，而不能实现对OsWx基因的表达水平量进行调控，从而适度调整直链淀粉到各种含量水平。因此，利用基因组编辑技术研发能同时适量调控作物直链淀粉含量和胶稠度的方法，对于快速培育具有不同直链淀粉含量和胶稠度，改良食味品质和加工特性的作物新品种具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有调控作物种子直链淀粉含量的方法的缺陷和不足，提供一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法及其应用。本专利技术的目的是提供一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法。本专利技术另一目的是提供所述方法在调控作物种子直链淀粉含量和/或胶稠度中的应用。本专利技术又一目的是提供所述方法在培育优质水稻品系或品种中的应用。本专利技术再一目的是提供一种调控作物Wx基因表达水平的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首先提供了一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法，利用序列特异核酸酶基因组编辑技术对作物Wx基因的起始密码子上游部分进行位点特异性突变，创建作物Wx基因表达水平改变的突变系。所述位点特异性突变能够改变Wx基因的5’非编码区(5’UTR)及其第一内含子区的前体RNA剪接点及其旁边序列，使之剪接效率改变，以及改变其启动子区序列而影响其转录活性，从而有效地对作物Wx基因进行表达调控，得到了作物Wx基因表达水平改变的突变系。优选地，所述位点特异性突变的方法为：选择作物Wx基因的起始密码子上游部分中的一个或多个靶点，构建含不同靶点引导RNA的敲除载体，转化入作物。更优选地，所述含不同靶点引导RNA为sgRNA表达盒。优选地，所述起始密码子上游部分为启动子调控区或5’UTR调控区。优选地，所述序列特异核酸酶基因组编辑技术为CRISPR/Cas基因组编辑技术。更优选地，所述CRISPR/Cas基因组编辑技术为CRISPR/Cas9基因组编辑技术。优选地，所述作物Wx基因为水稻OsWx基因。所述水稻OsWx基因的起始密码子上游部分的序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述水稻OsWx基因的起始密码子上游部分的靶点为T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10或T11中的任意一种或几种的组合；所述靶点T1～T11的序列依次分别如SEQIDNO.2～12所示。更优选地，所述靶点为双靶点T1/T2、T3/T4、T5/T6、T7/T8、T9/T10或单靶点T11。本专利技术研究发现：对上述靶点进行单敲除或组合敲除可获得Wx基因表达水平不同的突变系，进而得到直链淀粉含量不同的多个突变系，实现对作物直链淀粉含量的人为调控。比如，在经过CRISPR/Cas基因组编辑技术编辑的T2代纯合突变植株中，OsWxa基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法，其特征在于，利用序列特异核酸酶基因组编辑技术对作物Wx基因的起始密码子上游部分进行位点特异性突变，创建作物Wx基因表达水平改变的突变系。/n

【技术特征摘要】
1.一种调控作物种子直链淀粉含量和胶稠度的方法，其特征在于，利用序列特异核酸酶基因组编辑技术对作物Wx基因的起始密码子上游部分进行位点特异性突变，创建作物Wx基因表达水平改变的突变系。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述位点特异性突变的方法为：选择作物Wx基因的起始密码子上游部分中的一个或多个靶点，构建含不同靶点引导RNA的敲除载体，转化入作物。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述起始密码子上游部分为启动子调控区或5’UTR调控区。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述序列特异核酸酶基因组编辑技术为CRISPR/Cas基因组编辑技术。


5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述作物Wx基因为水稻OsWx基因。


6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘耀光，祝钦泷，曾栋昌，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44