本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法，通过构建的pOGT载体构建重组基因载体，重组基因载体携带外源基因导入拟南芥中后，转基因拟南芥种子能够观察到荧光，与野生型拟南芥区分开来。本发明专利技术公开的pOGT植物表达载体体系避免了抗生素或除草剂对发育缺陷型植株的危害，摆脱了对无菌工作环境和大面积种植空间的需求，缩短了获得转基因植株的时间和成本。
【技术实现步骤摘要】
一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法。
技术介绍
转基因拟南芥的出现极大地促进了植物基因功能的研究。筛选转基因拟南芥是鉴定阳性转基因植株的重要步骤。筛选转基因植株通常需要一个选择性标记基因，这些基因多为抗生素抗性或除草剂抗性基因。这种筛选方法在很长一段时间内为我们提供了便利，但通过这种方法获得转基因拟南芥却存在着一些难以避免问题：第一，虽然转基因植株携带抗生素或除草剂抗性基因等选择性标记，但转基因导致的发育缺陷型植株可能对抗生素或除草剂十分敏感[ToxicReactivityofWheat(Triticumaestivum)PlantstoHerbicideIsoproturon.YinXL,JiangL,SongNH,YangH.AgrFoodChem.2008；56(12):4825-4831.]；第二，传统的选择性标记需要无菌工作条件、大批的植物处理量和植物种植空间。这些因素在一定程度上为建立转基因拟南芥株系带来了困难。拟南芥种子中分布着大量的油体蛋白(Oleosin,OLEs)。OLE1(At4g25140)是油体蛋白的一种，存在于种子的整个发育时期，保证种子正常萌发[AnovelroleforoleosinsinfreezingtoleranceofoilseedsinArabidopsisthaliana.Plant.ShimadaTL,TomooS,HideyukiT,FukaoY,Hara-NishimuraI.2010；55(5):798-809.]。pCXSN质粒是一种商业载体，可用于植物超量表达载体构建。pCXSN载体存在一段ccdB致死基因，转入普通大肠杆菌菌株(例如DH5a和Trans1-T1)中将导致菌株死亡，将pVS1StaA和KanR基因的XcmI位点突变后，用限制性内切酶XcmI酶切后可切除pCXSN载体上的ccdB致死基因，形成T载体，连入基因后可以直接转化普通大肠杆菌菌株[AVersatileZeroBackgroundT-VectorSystemforGeneCloningandFunctionalGenomics.ChenSB,SongkumarnP,LiuJL,WangGL.PlantPhysiol.2009；150(3):1111-1121.]。
技术实现思路
本专利技术以pCXSN植物表达载体为载体骨架，ProOLE1::OLE1::GFP种子荧光蛋白基因为筛选标记基因开发了一种的新型植物表达载体，并将其命名为pOGT(plasmidofOLE1-GFPT-vector)。pOGT载体经XcmI酶切后变成T载体，通过TA克隆可以将外源PCR片段克隆到pOGT载体中，随后将得到的重组载体导入拟南芥中，利用种子荧光完成转基因拟南芥的筛选。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法，包括以下步骤：(1)从拟南芥基因组中扩增ProOLE1::OLE1片段，克隆到pA7-GFP载体中，得到重组载体pA7-OLE1-GFP；(2)以重组载体pA7-OLE1-GFP为模板，克隆ProOLE1::OLE1-GFP片段；将克隆到的ProOLE1::OLE1-GFP片断插入pCXSN载体中，得到重组载体pCXSN-OLE1-GFP；(3)突变重组载体pCXSN-OLE1-GFP上ProOLE1的XcmI位点得到pOGT载体；(4)采用pOGT载体构建重组基因载体，将重组基因载体转入感受态细胞，选择正确单克隆，侵染拟南芥得到转基因拟南芥种子，转基因种子能够观察到荧光。进一步，所述步骤(1)中，重组载体pA7-OLE1-GFP的构建方法为：根据拟南芥OLE1基因及其启动子序列，设计合成特异性引物pOLE1-F、pOLE1-R，以拟南芥基因组为模板，克隆OLE1基因的启动子和OLE1基因(ProOLE1::OLE1)；SalⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切pA7-GFP载体后回收4591bp线性化pA7-GFP片段，将克隆得到的ProOLE1::OLE1片段克隆到pA7-GFP载体中，即得重组载体pA7-OLE1-GFP；特异性引物pOLE1-F、pOLE1-R，其序列为分别为：ACGAACGATACTCGAGCACCCTACTTAGATCAACACATA和TCACTAGTACGTCGACAGTAGTGTGCTGGCCACC。进一步，所述的步骤(2)中，重组载体pCXSN-OLE1-GFP的构建方法为：根据ProOLE1::OLE1-GFP序列设计合成一对特异性引物pOGT-F和pOGT-R，以pA7-OLE1-GFP质粒为模板，pOGT-F、pOGT-R为引物，克隆ProOLE1::OLE1-GFP片段；HindⅢ酶切pCXSN载体，回收10802bp线性化pCXSN大片段；用同源重组酶将ProOLE1::OLE1::GFP片段插入到pCXSN载体的HindⅢ酶切位点之间，然后转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞，得到pCXSN-OLE1-GFP重组载体；特异性引物pOGT-F和pOGT-R其序列分别为：GCAGGCATGCAAGCTTCACCCTACTTAGATCAACACAT；pOGT-R其序列为：GGCCAGTGCCAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATG。进一步，所述的步骤(3)中，突变重组载体pCXSN-OLE1-GFP上ProOLE1的XcmI位点的方法，采用QuickMutationTM基因定点突变试剂盒说明书(Biyotime公司)中的突变ProOLE1的XcmI位点突变方法，点突变引物为PM-XcmⅠ-F、PM-XcmⅠ-R，PM-XcmⅠ-F其序列为：TCGGTCTTGGTCACACAAGGAACTCTCTGGTAA；PM-XcmⅠ-R其序列为：TTACCAGAGAGTTCCTTGTGTGACCAAGACCGA。进一步，所述步骤(4)中，重组基因载体的构建方法为：XcmI酶切pOGT载体，回收大片段，得到T载体；在外源基因末端加上腺嘌呤脱氧核糖核苷酸后用T4连接酶连入T载体；将连接产物转入大肠杆菌菌株Trans1-T1，得到重组基因载体。进一步，所述的重组基因载体的基因为木薯MeEXPA30基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。进一步，木薯MeEXPA30基因转入拟南芥中所采用的方法为：XcmI酶切pOGT载体，回收收大片段，得到T载体；在外源基因MeEXPA30末端加上腺嘌呤脱氧核糖核苷酸后用T4连接酶连入T载体，热激法将连接产物转入大肠杆菌菌株Trans1-T1；37℃过夜培养后，得到pOGT-MeEXPA30重组载体；将pOG-MeEXPA30载体转入感受态细胞，侵染拟南芥得到转基因拟南芥种子。进一步，侵染拟南芥的方法选择浸花法。进一步，所用的感受态细胞为GV3101根癌农杆菌。本专利技术的有益效果：采用本专利技术所述的pOGT载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)从拟南芥基因组中扩增Pro
【技术特征摘要】
1.一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从拟南芥基因组中扩增ProOLE1::OLE1片段，克隆到pA7-GFP载体中，得到重组载体pA7-OLE1-GFP；
(2)以重组载体pA7-OLE1-GFP为模板，克隆ProOLE1::OLE1-GFP片段；将克隆到的ProOLE1::OLE1-GFP片断插入pCXSN载体中，得到重组载体pCXSN-OLE1-GFP；
(3)突变重组载体pCXSN-OLE1-GFP上ProOLE1的XcmI位点得到pOGT载体；
(4)采用步骤(3)中所述的pOGT载体构建重组基因载体，将重组基因载体转入感受态细胞，选择正确单克隆侵染拟南芥得到转基因拟南芥种子，转基因拟南芥种子能够观察到荧光。
2.如权利要求1所述的一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，重组载体pA7-OLE1-GFP的构建方法为：根据拟南芥OLE1基因及其启动子序列，设计合成特异性引物pOLE1-F、pOLE1-R，以拟南芥基因组为模板，克隆OLE1基因的启动子和OLE1基因(ProOLE1::OLE1)；SalⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切pA7-GFP载体后回收4591bp线性化pA7-GFP片段，将克隆得到的ProOLE1::OLE1片段克隆到pA7-GFP载体中，即得重组载体pA7-OLE1-GFP；特异性引物pOLE1-F、pOLE1-R，其序列为分别为：ACGAACGATACTCGAGCACCCTACTTAGATCAACACATA和TCACTAGTACGTCGACAGTAGTGTGCTGGCCACC。
3.如权利要求1所述的一种利用种子荧光快速鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中，重组载体pCXSN-OLE1-GFP的构建方法为：根据ProOLE1::OLE1-GFP序列设计合成一对特异性引物pOGT-F、pOGT-R，以pA7-OLE1-GFP质粒为模板，pOGT-F、pOGT-R为引物，克隆ProOLE1::OLE1-GFP片段；HindⅢ酶切pCXSN载体，回收10802bp线性化pCXSN大片段；用同源重组酶将ProOLE1::OLE1::GFP片段插入到pCXSN载体的HindⅢ酶切位点之间，然后转化大肠杆菌DB...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗丽娟，李敏，刘秦，吴远航，刘攀道，蒋凌雁，陈银华，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南;46
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