定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法、ELISA试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD‑L1含量的方法、ELISA试剂盒及使用方法，利用抗EGFR抗体特异性捕获肿瘤来源的细胞外囊泡，利用抗PD‑L1抗体检测细胞外囊泡中PD‑L1蛋白的含量，利用构建的EGFR‑PD‑L1融合蛋白作为标准品实现对肿瘤来源细胞外囊泡中PD‑L1的定量检测。现有的ELISA检测策略只能检测体液中总PD‑L1水平或者总细胞外囊泡上PD‑L1水平，本发明专利技术利用“双抗夹心”ELISA策略，实现了特异性和定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡所携带的PD‑L1的含量，具有明显的优势。

【技术实现步骤摘要】
定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法、ELISA试剂盒及使用方法
本专利技术涉及分子生物学和生物
，具体涉及一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法、ELISA试剂盒及使用方法。
技术介绍
最新的数据显示，全球每年新增恶性肿瘤患者1810万人，死亡960万人，恶性肿瘤已经是严重威胁人类健康和生命的疾病。大多数恶性肿瘤患者在确诊时已处于晚期，失去了手术机会，且对放化疗等保守治疗方式不敏感，因此预后普遍较差。然而，近几年来免疫治疗的兴起为晚期恶性肿瘤患者带来了希望，其中针对免疫检查点程序性凋亡配体-1/程序性死亡受体-1(PD-L1/PD-1)通路的抑制剂是目前肿瘤免疫治疗的代表性药物。尽管PD-L1/PD-1免疫治疗疗效显著，甚至可以完全消除肿瘤达到治愈效果，但PD-L1/PD-1免疫治疗并非对每一个患者都有效。临床试验结果表明，仅有不到30％的患者能够从PD-L1/PD-1免疫治疗中获益。加之不仅治疗费用高，且治疗周期长，若治疗无效，患者将丧失及时接受其他治疗的时机。更重要的是，免疫治疗引起的不良反应也不容忽视。因此寻找能够在治疗早期预测免疫治疗疗效的生物标志物是当务之急。细胞外囊泡(Extracellularvesicles，EVs)是由细胞分泌产生的一类直径介于50-1000nm的双层磷脂分子组成的膜结构的统称，其携带丰富的生物活性分子(如蛋白质、核酸等)，并可通过自分泌或旁分泌途径参与对局部或远处细胞的功能调控，影响细胞外微环境。专利技术人前期发表于Nature(ExosomalPD-L1contributestoimmunosuppressionandisassociatedwithanti-PD-1response,GangChen等，Nature,2018年560卷7718期382-386页)的一项研究显示，肿瘤细胞分泌富含PD-L1的细胞外囊泡进入机体外周循环系统参与免疫抑制；更重要的是，专利技术人还发现肿瘤患者外周血中的肿瘤细胞来源的细胞外囊泡携带的PD-L1水平，在肿瘤进展以及免疫治疗的不同阶段，呈现有规律的动态变化。因此，定量检测肿瘤患者体液(尤其是外周血)中肿瘤细胞外囊泡携带的PD-L1水平，将有望成为预测恶性肿瘤进展、预后以及免疫治疗疗效的液体活检的新标志物。基于以上结果，专利技术人前期提出了一种基于肿瘤患者外周血细胞外囊泡上PD-L1浓度水平ELISA检测策略，并用于预测免疫治疗有效性。该ELISA策略，以抗PD-L1抗体作为捕获抗体，将细胞外囊泡固定于ELISA孔板中，利用抗PD-L1抗体来检测细胞外囊泡上的PD-L1水平，利用PD-L1标准蛋白对细胞外囊泡中PD-L1水平进行定量。然而，已有研究表明患者体液中既存在细胞外囊泡上的PD-L1，还存在大量游离的PD-L1蛋白。如果直接对体液进行针对PD-L1的ELISA检测，将受到游离PD-L1的干扰。因此，为了避免游离PD-L1的干扰，该策略需要预先利用超速离心法对体液中的细胞外囊泡进行分离和纯化。超速离心法不仅耗时费力，没有标准化的操作流程需要大型的超速离心设备，不利于临床推广应用；更重要的是，超速离心法分离细胞外囊泡的效率不足30％。这30％的细胞外囊泡中PD-L1的水平能否准确反映总细胞外囊泡中PD-L1水平目前仍然不清楚。更重要的是，目前已经证实正常细胞(如巨噬细胞、单核细胞等)也可以分泌携带PD-L1的细胞外囊泡。尽管现有的ELISA策略能检测位于细胞外囊泡上的PD-L1，显然无法准确判定PD-L1+的细胞外囊泡是否来自肿瘤细胞。正常细胞分泌的PD-L1+的细胞外囊泡对定量检测肿瘤来源细胞外囊泡中PD-L1带来了极大的干扰。因此，亟待建立一种可以特异性和定量检测体液中肿瘤来源的细胞外囊泡中PD-L1水平的ELISA策略，以提高免疫治疗疗效预测的准确率，促进免疫治疗的长足发展。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，不仅避免了体液中游离PD-L1的干扰，而且还避免了正常细胞分泌的PD-L1+细胞外囊泡的干扰，可以特异低和准确地定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡上PD-L1蛋白水平。本专利技术的目的之二在于提供一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒，可以快速特异性定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡中PD-1的含量。本专利技术的目的之三在于提供一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒的使用方法。本专利技术实现目的之一所采用的方案是：一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，利用抗EGFR抗体特异性捕获体液中肿瘤来源的细胞外囊泡，利用抗PD-L1抗体检测细胞外囊泡中PD-L1蛋白的含量，利用构建的EGFR-PD-L1融合蛋白作为标准品实现对肿瘤来源细胞外囊泡中PD-L1的定量检测。研究表明，EGFR在多种上皮源性恶性肿瘤中表达水平均出现明显的升高，如口腔癌、肺癌、尿路上皮癌、肝癌、乳腺癌、脑胶质瘤等。已广泛用于肺癌、口腔癌临床的西妥昔单抗正是针对恶性肿瘤细胞这一特征开发的靶向治疗药物。根据细胞外囊泡形成机制，高表达EGFR的肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡则继承了母细胞的EGFR。基于上述研究现状，本专利技术中提出了一种体液PD-L1水平ELISA检测新方法，该方法以抗EGFR抗体作为体液细胞外囊泡的捕获抗体，以抗PD-L1抗体作为检测抗体，以本专利技术构建的EGFR-PD-L1融合蛋白作为标准品，从而实现定量检测体液中肿瘤来源的细胞外囊泡PD-L1含量。该方法与现有的ELISA检测方法相比，不仅避免了体液中游离PD-L1的干扰，而且还避免了正常细胞分泌的PD-L1+细胞外囊泡的干扰，可以特异地和准确地定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡上PD-L1蛋白水平。本方法将在恶性肿瘤的早期诊断、预后评估、免疫治疗疗效预测等方面有着广阔的应用前景。优选地，所述EGFR-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：1所示。优选地，所述抗EGFR抗体可替换为抗EpCAM抗体或抗HER2抗体；利用构建的对应的EpCAM-PD-L1融合蛋白或HER2-PD-L1融合蛋白作为标准品。本专利技术利用肿瘤特异性表达的标志分子作为肿瘤来源细胞外囊泡的捕获靶标，本专利技术以EGFR为例展示检测的策略和方法。根据不同肿瘤表达的标志物的差异，可根据实际检测要求和肿瘤类型，对捕获抗体进行选择和自主搭配，包括但不限于EpCAM、HER2等肿瘤标志分子对应的抗体作为捕获抗体。优选地，所述体液包括血液、唾液、尿液、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、汗液、精液、淋巴液中的任意一种；所述肿瘤包括口腔癌、肺癌、尿路上皮癌、肝癌、乳腺癌、脑胶质瘤中任意一种。除血液为针对全身各型癌症外，所采集的其余体液为针对所检测癌症的特异性部位液体，如针对口腔及邻近部位癌症的唾液、针对尿路上皮癌的尿液、针对肺癌的胸腔积液、针对脑胶质瘤的脑脊液等。体液样本，包括但不局限于人、猴、小鼠、大鼠、兔、猪、猴、狗等动物。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，其特征在于：利用抗EGFR抗体特异性捕获体液中肿瘤来源的细胞外囊泡，利用抗PD-L1抗体检测细胞外囊泡中PD-L1蛋白的含量，利用构建的EGFR-PD-L1融合蛋白作为标准品实现对肿瘤来源细胞外囊泡中PD-L1的定量检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，其特征在于：利用抗EGFR抗体特异性捕获体液中肿瘤来源的细胞外囊泡，利用抗PD-L1抗体检测细胞外囊泡中PD-L1蛋白的含量，利用构建的EGFR-PD-L1融合蛋白作为标准品实现对肿瘤来源细胞外囊泡中PD-L1的定量检测。


2.根据权利要求1所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，其特征在于：所述EGFR-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：1所示。


3.根据权利要求1所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，其特征在于：所述抗EGFR抗体可替换为抗EpCAM抗体或抗HER2抗体；利用构建的对应的EpCAM-PD-L1融合蛋白或HER2-PD-L1融合蛋白作为标准品。


4.根据权利要求1所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的方法，其特征在于：所述体液包括血液、唾液、尿液、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、汗液、精液、淋巴液中的任意一种；所述肿瘤包括口腔癌、肺癌、尿路上皮癌、肝癌、乳腺癌、脑胶质瘤中任意一种。


5.一种定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒，其特征在于：包括ELISA酶标板、封板膜、标准蛋白、标准蛋白稀释液、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体A、酶标抗体B、显色剂A液、显色剂B液和终止液；
其中，所述ELISA酶标板为按1-5μg/mL浓度提前包被好抗EGFR抗体的酶标板；
所述标准蛋白为构建的EGFR-PD-L1融合蛋白。


6.根据权利要求5所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒，其特征在于：所述EGFR-PD-L1融合蛋白的核酸序列如SEQIDNo：1所示。


7.根据权利要求5所述的定量检测体液中肿瘤来源细胞外囊泡PD-L1含量的ELISA试剂盒，其特征在于：所述ELISA酶标板可替换为按1-5μg/mL浓度提前包被好抗EpCAM抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈刚，余自力，刘金元，吴敏，赵怡芳，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42