一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD‑L1表达的试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。试剂盒包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、抗人PD‑L1一抗100μL、山羊抗人 IgG/HRP 100μL、0.1% Triton X‑100 100μL、0.3% H

【技术实现步骤摘要】
一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，也是预后最差的恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤所导致的死亡中，胰腺癌排第四位，90％患者在确诊后一年内死亡，5年生存率不足10％。由于胰腺癌早期症状隐匿，且没有特异性，侵袭性强，转移早，手术切除率低，确诊时病情多处于中晚期，对其治疗目前基本是全身化疗治疗。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液体活检”。最新研究表明，晚期胰腺癌化疗联合免疫治疗疗效可能有一定的提高，但PD-1抑制剂疗效肿瘤细胞PD-L1表达相关；由于胰腺属于腹膜后位脏器，胰腺肿瘤穿刺活检面临出血、胰瘘、感染等风险，亦不能实时动态检测PD-L1表达状态，因此对晚期胰腺癌患者外周血中基于循环肿瘤细胞PD-L1检测对胰腺癌免疫联合化疗治疗具有重要临床指导意义，使部分患者避免不必要的手术创伤及穿刺风险。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位，对于循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术进行产业化推广的研究，本项目为山东省重大科技创新工程项目，本项目将以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行产业化推广。
技术实现思路
为了解决实时动态检测PD-L1表达的问题，同时避免穿刺活检面临出血、胰瘘、感染等风险，本专利技术提供了一种胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达非诊断目的的检测方法，利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫组化技术检测CTC的PD-L1表达情况。本专利技术采用的技术方案如下：一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、抗人PD-L1一抗100μL、山羊抗人IgG/HRP100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A15ml、试剂B50ml、6×PBS缓冲液60mL。所述稀释液包括：含量为0.5g/L的乙二胺四乙酸盐，含量为6g/L的硫酸钠；含量为4g/L的氯化钠，含量为2g/L的二羟基甲基脲，含量为6g/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸；含量为0.5g/L的十二烷基磺基甜菜碱，含量为0.5g/L的叠氮钠，含量为0.3g/L的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，其余是水。所述脱色液是由乙醇与醋酸按体积比1:2组成。所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。所述试剂A为甲醛-二甲苯按照体积比1：3组成；所述试剂B为二甲苯。上述的试剂盒非诊断目的检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的方法，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液45ml进行稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（5）运用免疫组化技术检测CTC的PD-L1表达情况。步骤（5）所述检测CTC的PD-L1表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；（2）滴加100μl0.1%TritonX-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；（3）滴加100μl0.3%H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μl抗人PD-L1一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；（5）滴加100μl山羊抗人IgG/HRP，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；（6）滴加100μlDAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；（9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇，95%乙醇，100%乙醇梯度乙醇脱水各10min，然后加入15mL试剂A，振荡均匀后过滤；加入试剂B，脱色30min，干燥，中性树脂封固；（10）光学显微镜下镜检。本专利技术所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为8微米的滤孔。免疫抑制与免疫逃逸和肿瘤细胞PD-L1的过表达密切相关，肿瘤细胞可通过其表面的PD-L1与免疫细胞T细胞表面的PD-1结合，传导抑制性信号，使得T细胞不能识本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、抗人PD-L1一抗100μL、山羊抗人 IgG/HRP 100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H

【技术特征摘要】
1.一种检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、抗人PD-L1一抗100μL、山羊抗人IgG/HRP100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A15ml、试剂B50ml、6×PBS缓冲液60mL。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液包括：含量为0.5g/L的乙二胺四乙酸盐，含量为6g/L的硫酸钠；含量为4g/L的氯化钠，含量为2g/L的二羟基甲基脲，含量为6g/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸；含量为0.5g/L的十二烷基磺基甜菜碱，含量为0.5g/L的叠氮钠，含量为0.3g/L的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，其余是水。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由乙醇与醋酸按体积比1:2组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A为甲醛-二甲苯按照体积比1：3组成；所述试剂B为二甲苯。


6.一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒非诊断目的检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发胰腺癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液45ml进行稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔凯，李胜，黄宁，胡敏，戚元刚，
申请(专利权)人：山东省肿瘤防治研究院山东省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：山东;37